IgA肾病是我国最常见的原发性肾小球疾病，也是临床上导致终末期肾病的病因之一。其主要病理特征是免疫复合物沉积于肾小球系膜区^[1]。研究表明，IgA肾病患者血清、肾组织及腭扁桃体均能检测到高于健康人水平的半乳糖基化缺陷的IgA1(galactose-deficient IgA1,Gd-IgA1)，后者可诱导机体产生特异性识别Gd-IgA1 分子的免疫球蛋白IgG(glycan-IgG)，二者结合形成的稳定免疫复合物可沉积于肾小球系膜区，并通过募集补体、细胞因子等途径介导肾脏损伤^[2]。目前临床上主要使用血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)及免疫抑制剂等药物治疗IgA肾病，但上述药物并未针对IgA肾病的特有发病机制进行靶向干预，而且不良反应明显、疗效欠佳^[3]。因此研究开发特异性针对IgA肾病发病机制的靶向性药物，成为当前IgA肾病治疗方面的热点。

Suzuki等^[4]成功分离出IgA肾病患者外周血单个核细胞并对其进行EB病毒永生化，进而亚克隆出产Glycan-IgG的B细胞系，通过对该细胞分泌的IgG分子抗原结合区重链及轻链测序，他们发现了一段存在于IgG重链CDR3区的氨基酸片YCSR是IgA肾病患者所共有，而健康人对应的序列则为YCAR。进一步研究发现CDR3区的氨基酸序列(YCSR/K)，该序列是Glycan-IgG能够特异性识别Gd-IgA1的核心序列。其中片段为“YCSRDRYGLFDYW”的肽段长度最短，并且与Gd-IgA1分子结合能力强。本课题组前期以病毒样颗粒为平台的分子载体设计研究显示，通过PCR定点突变技术插入PH肽段，该序列可作为VLPs特异性识别IgA肾病患者Gd-B细胞表面膜型IgA1分子的模拟肽^[5]。基于该理论，本实验设计并表达含有该特殊模拟肽的HPV16 L1-PH重组质粒，将上述质粒电转转入毕赤酵母菌内，表达HPV16 L1-PH嵌合蛋白，鉴定并纯化获得的目的蛋白。后者可在组装缓冲液中自我组装成VLPs，并且将PH肽暴露于VLPs表面，表面肽段引导VLPs识别Gd-B细胞，引起细胞内化VLPs，从而达到递送外源基因进入细胞内的目的。VLPs解聚和重组装可通过透射电镜观察。此外，VLPs目前作为宫颈癌疫苗已用于临床，显示了它作为基因载体的安全性。而且经改造后VLPs可降低机体对其产生的免疫排斥反应，是一种比较理想的基因递送载体^[6]。制备获得的HPV16 L1-PH嵌合蛋白可用于IgA肾病下一步实验研究。

毕赤酵母宿主菌GS115由武汉华美生物工程有限公司提供；HPV16 L1-PD质粒委托上海生工构建；增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达型质粒由美国Putterman教授惠赠。

限制性内切酶Sac Ⅰ、凝胶回收试剂盒及Taq DNA Polymerase均购自Fermentas公司；T4 DNA Ligase购自天根生化科技有限公司；G418购自Invitrogene公司；电转化仪购自Ependorf公司；Hitachi公司H-7000FA透射电镜由中科院武汉病毒所提供使用。

根据本研究所保存测序正确HPV16 L1-PD质粒设计引物，采用PCR定点突变技术，将HPV16 L1-PD基因中PD序列替换成PH序列。提前进行引物设计(表 1)。首先以基础质粒HPV16 L1-PD模板，用正向侧引物F1和反向引物R2进行PCR扩增，然后以此模板用正向侧引物F1和反向侧引物R1进行第二轮PCR扩增，回收得到片段S1。再次以质粒HPV16 L1-PD为模板，用正向引物F2和反向引物R3进行PCR扩增，然后以此为模板用正向侧引物F3和反向侧引物R3扩增，产物回收获得片段S2。最后通过重叠延伸PCR法连接片段S1及S2。获得的目的片段再连接pPIC9K表达载体，获得的HPV16-9K重组质粒经转化涂板筛选阳性克隆，鉴定出的正确克隆送公司测序。

表 1(Table 1)

表 1 PCR定点突变所需引物 引物 序列(5′-3′) F1 GACTATGTCTCTTTGGCTGCCTAGTG R1 CTGGTACATTTTCACCAACCCAGTAGTCGAACAGACCGTAACGGTCACGGG F2 GTGACCGTTACGGTCTGTTCGACTACTGGGTTGGTGAAAATGTACCAG R2 GACCGTAACGGTCACGGGAGCAGTAAGCACCAGCCCTATTAAATA F3 TATTTAATAGGGCTGGTGCTTACTGCTCCCGTGACCGTTACGGTCTGTTC R3 GGCCTTTACAGCTTACGTTTTTTGCGTTT

表 1 PCR定点突变所需引物

将重组表达载体用Sac Ⅰ线性化后电转化GS115感受态细胞。电转化后转化子涂布在RDB+G418平板(G418浓度为1 mg/ml)，4 d后长出300个左右单菌落。从RDB+G418平板上随机选取20个菌落，并编上1-20序号，挑取适量编有序号的菌落于对应编号的PCR管反应体系中，同时往阴性对照PCR体系中加入0.1 μl去离子水，阳性对照PCR体系中加入0.1 μl质粒模板，PCR管置于PCR扩增仪扩增，取5 μl PCR产物1%琼脂糖胶电泳检测后扩大培养。然后用1 mol/L Tris pH 9.0将浓缩后的上清调pH至8.0。多次冲洗柱床后以1 ml/min的流速将处理好的样品过柱。上样结束后用溶液NTA-0冲洗柱床到G250检测基本不显色。用250 mmol/L咪唑冲洗柱床。G250检测有蓝色开始收集洗脱峰，G250检测基本无色停止收集洗脱峰。再次冲洗柱床，用10 kU超滤管超滤洗脱液至1-2 ml。然后进行SDS-PAGE分析，然后从SDS-PAGE胶上45-66 kU处切下1个胶点，加入终浓度10 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)还原蛋白质，接着加入终浓度55 mmol/L碘乙酸铵(IAM)，最后加入1 μg的Trypsin酶，过夜酶解8-16 h。酶解产生的多肽用C18柱子除盐，已经除盐的多肽抽干后用15 μl Loading Buffer(0.1%甲酸,3%乙腈)溶解多肽。多肽上LC-MS/MS仪器进行分析，然后对结果进行评估。

将新鲜制备的疫苗取20 μl滴于200目铜网上,吸附3 min。吸水纸吸干,晾干30 s。以1%质量体积分数的水溶性醋酸铀负染30 s,吸水纸吸干,晾干30 s。75 kV透射电镜H-7000FA观察。

首先，将5 μg纯化的HPV病毒样颗粒在含150 mmol/L NaCl,1 mmol/L EGTA和20 mmol/L DTT终体积为50 μl解组装缓冲液中，室温孵育30 min。将2 μg表达质粒溶解在10 μl含有50 mmol/L Tris-HCl buffer(pH 7.5)和150 mmol/L NaCl的溶液中，然后加入解组装缓冲液，然后以每小时1 mmol/L逐渐梯度增加CaCl₂浓度至终浓度5 mmol/L,送电镜观察。

PCR定点突变技术构建的S1和S2产物，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测鉴定，均在800 bp左右有特异性条带。通过重叠延伸PCR法连接片段S1及S2，产物通过琼脂糖凝胶检测有特异的大小约1 600 bp的正确条带。将该嵌合质粒送公司测序，测序结果表明，所构建的表达质粒目的片段HPV-L1-PH序列正确无突变序列。获得的HPV16-9K重组质粒用Sac Ⅰ线性化，酶切效率为100%(图 1)。

图 1(Figure 1)

图 1 人 HPV16-9K重组质粒及线性化 产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 1：人HPV16-9K重组质粒； 2:人HPV16-9K重组质粒 Sac Ⅰ酶切线性化回收产物；M：DL 10 000 DNA Marker

分别从RDB+G418平板上随机选取20个菌落、0.1 μl去离子水阴性对照、0.1 μl质粒模板阳性对照，产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见约1 600 bp的基因片段，与理论预测值相符。见图 2。

图 2(Figure 2)

图 2 HPV16-9K线性化产物转化 GS115菌落PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图 1-20：平板随机挑取的20个菌落；21：阳性对照；22：阴性对照；23：marker

将甲醇诱导表达的每天取样进行TCA浓缩电泳，以第一次加甲醇的时刻为零时刻，大约48 h后，将培养液倒入两个500 ml离心管,6 000 r/min，4 ℃离心10 min。收集上清。然后用1 mmol/L Tris将浓缩后的上清调pH至8.0，然后用Ni柱层析，最后超滤管超滤。分别将收集上清浓缩液、上清浓缩液过柱穿透液、NTA-250洗脱收集液经SDS-PAGE分析，显示在45-66.2 kU之间有明显的特异性条带，这与HPV-L1-PH嵌合蛋白理论大小60 kU一致(图 3)。从SDS-PAGE胶上45-66 kU处切下1个胶点，送公司做质谱分析，鉴定结果显示有很高的多肽覆盖度和多肽总数，可以确定所检测胶点中的蛋白质为目标蛋白质。

图 3(Figure 3)

图 3 HPV-L1-PH嵌合蛋白SDS-PAGE分析 M：Marker；1：上清浓缩液；2：上清浓缩液过柱穿透液；3：NTA-250洗脱收集液

纯化后的蛋白浓度测定为1 mg/ml，取2 μg蛋白用PBS稀释到20 μl，通过扫描电镜观察，可见直径约55 nm的球形颗粒，与预测值一致(图 4)。

图 4(Figure 4)

图 4 纯化后的HPV-L1-PH病毒样颗粒 (放大倍数100 000，Bar代表 100 nm)

收集的病毒样颗粒加入解组装缓冲液，6 h后透射电镜观察，观察到大量颗粒物，直径约9.5-11 nm之间，其大小与天然HPV16病毒样颗粒五聚体大小相近(图 5)。然后再向解聚成功后的病毒样颗粒加入EGFP表达型质粒50 μg，梯度增加缓冲液中氯化钙浓度过夜后电镜观察，组装后病毒样颗粒恢复到原来的病毒样颗粒结构(图 6)。

图 5(Figure 5)

图 5 HPV-L1-PH病毒样颗粒解聚后形成的颗粒 (放大倍数150 000，Bar代表 100 nm)

图 6(Figure 6)

图 6 HPV-L1-PH病毒样颗粒重组装电镜下观察 (放大倍数100 000，Bar代表 100 nm)

IgA肾病预后欠佳，既往研究显示大约20%-30% IgA肾病患者10到20年内即可进展至终末期肾病^[7]。IgA肾病病理特征主要表现为肾小球系膜区IgA1和补体C3的沉积，少数伴有IgG或IgM沉积^[8]。目前普遍认为Gd-IgA1分子是IgA肾病发病的始动因素^[9]。近年来，国内外多项GWAS研究发现多个与IgA肾病发病有关的异常基因^[10]。Serino等^[11]研究利用miRNA微阵列芯片技术发现IgA肾病患者外周血单个核细胞异常升高的miR-148b与患者循环中Gd-IgA1分子水平升高密切相关。以上研究提示，遗传信息异常与IgA肾病发生发展密切相关。

基因治疗是指将外源基因导入靶细胞，纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。基因载体是基因治疗的递送工具，主要分为病毒载体和非病毒载体：病毒载体就是病毒的外壳或外膜；非病毒载体主要是人工的转导材料，如脂质体、多价阳离子高分子材料。目前应用于临床试验的基因治疗载体比较少，主要受限于其靶向性及安全性，这是基因治疗当前研究热点。基于IgA肾病患者基因异常及Gd-IgA1分子的产生与IgA肾病的发生发展的密切关系，IgA肾病的基因治疗有望成为治疗IgA肾病新方向。人工构造的VLPs具有免疫原性弱，仅诱导机体产生低滴度的中和抗体等优点，现相似构造的疫苗已大范围应用于临床^[12]。因此基于上述IgA肾病机制及本课题组既往研究成果，本研究利用暴露在VLPs表面的模拟肽特异性识别Gd-B细胞表面的糖基化缺陷的膜型IgA1分子，采取PCR定点突变技术设计并构建了HPV16 L1PH嵌合质粒，在毕赤酵母中表达并纯化了含有模拟肽PH的VLPs，经过SDS-PAGE及质谱分析获得了HPV-L1-PH嵌合蛋白，电镜下观察到VLPs的解聚和重组装的形态变化。但是需要指出的是，目前我们采用的毕赤酵母表达系统，还存在表达的嵌合蛋白产量低、蛋白纯度有待进一步提高、存在包涵体等问题。相较毕赤酵母表达系统，近年来经发展较快的昆虫表达系统具有较高克隆容量、高效表达、表达产物后加工完善等优点。下一步拟利用杆状病毒表达系统表达VLPs，并可以采用斑点杂交的方法提高筛选效率，还可通过体外位点特异性重组策略提高病毒的重组效率。用两种表达系统产生的VLPs同时感染Gd-B细胞，比较两者优缺点，建立筛选稳定高效的蛋白表达系统。

综上所述，本研究设计构建了HPV-L1-PH表达质粒，并成功表达了HPV-L1-PH嵌合蛋白，验证了VLPs的体外可控解聚和重组装能力。由于目前尚无从IgA肾病病人外周血B细胞中提取的产Gd-IgA1分子的商品化细胞系，我们下一步拟建立IgA肾病Gd-B稳定细胞系，进一步研究该病毒样颗粒对Gd-B细胞特异性的感染作用及效率。通过IgA肾病动物模型研究其靶向递送能力及评估其安全性。