非病毒基因载体系统由于其安全性而受到青睐，在该领域不断探索新方法试图提高目的基因转化效率以期达到与病毒载体相当的转染水平，如生物素-亲和素系统、抗原-抗体靶向结合等方式提高目的基因的携带率；带正电荷的阳离子聚合物聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)等与带负电荷的质粒DNA形成复合物使DNA固缩, 易于内吞和瞬时转染；脂质体可以增强细胞膜的通透性；物理方法有电穿孔和基因注射等，新型物理方法如超声靶向破坏微泡是利用超声微泡爆破时的致声孔作用瞬时、可逆提高细胞膜的通透性，促进基因载体复合物进入细胞^[1]。目前这些方法都局限于突破细胞膜屏障，但真核细胞除细胞膜外，还存在核膜。目前已知外源基因在体内进行有效表达至少需要克服以下三个主要屏障^[2]：①细胞膜是导入外源基因的第一道屏障，基因要进入细胞首先要穿过细胞膜进入细胞质；②细胞内DNA水解酶屏障，外源基因在进入细胞质后必须迅速入核，否则停留时间过长被细胞内DNA酶降解；③真核细胞细胞核屏障。核膜是控制细胞质和细胞核之间进行物质交换的通透屏障，是外源性基因转化的重要屏障，所有物质必须经过核孔复合物进行转运。分子质量小于60 kU，直径9 nm以下的小分子可通过被动扩散的方式通过核孔复合物进入细胞核内，但是大分子例如质粒DNA则必须经核定位信号(nuclear localization signal，NLS)介导的主动运输才能进入细胞核^[3]。

NLS一直以来是基因转移领域重点研究的一类功能性氨基酸序列，具有引导其所在序列趋向定位于核区的功能^[4]。经典的NLS (氨基酸多肽为PKKKRKV)是一段富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸的短肽，是介导外源性DNA或者蛋白质进入细胞核的必要信号片段。NLS介导的核输入至少分为两步：第一步是由NLS介导的信号识别过程，NLS肽在NLS的引导下被NLS受体识别形成核孔定位复合物，聚集在核孔复合物的胞质侧。第二步是温度、能量依赖的核转位过程，NLS肽穿过核孔进入细胞核^[5]。现阶段，利用NLS类短肽的核定位功能进行外源性基因转化试验已经取得了较大进展^{[6, 7]}。以很难转化的神经细胞为例，有研究将NLS与目的基因融合表达，可成功地将重组转录因子高效地传递进神经干细胞并诱导其向特定的神经细胞系发展^[8]。但不同的课题组采用的实验方法有所差别，导致NLS多肽提高目的基因的转化效率各不相同，因此有必要结合NLS的特点和优势，探讨如何更好的利用NLS作为入核向导，增加外源性DNA的入核率以提高转化效率，为后续的基因治疗提供良好的实验基础。

为促进细胞核摄入外源性基因，具有核定位信号的多肽被用来靶向和促进目的基因入核。NLS多肽与目的基因结合的方式主要分为非共价结合和共价结合两种。这些NLS肽可以与带负电荷的质粒DNA通过静电吸附的非共价结合方式相偶联，因为核定位信号肽中的氨基酸以精氨酸和赖氨酸为主，两者均带正电荷，与质粒DNA正好互补^[9]。另外，NLS也可以与非病毒基因载体中的阳离子聚合物PEI等结合或直接与DNA的磷酸盐骨架共价结合^[10]。

DNA和NLS的非共价结合主要有三种方式：DNA和NLS之间的静电作用、DNA通过核肽酸(PNA)桥梁连接NLS、通过生物素-亲和素系统连接DNA和NLS^[11]。最常用的经典NLS是阳离子多肽带正电荷，与带负电荷的DNA可以通过静电作用相结合，它可以增强分子质量达465 kU的非核蛋白的核输入^[12]。Collas等^[13]把经典NLS多肽通过离子间相互作用的方式与带荧光编码的质粒DNA相结合，并通过微注射的方式把该DNA-NLS复合物注入斑马鱼的胚胎细胞中，结果显示经典NLS增强了荧光素酶的表达，并促进了质粒DNA的核摄取。也有研究采用非经典的NLS多肽M9来增强脂质体的转化效率，由于其含有的离子残基比较少，因此需要加入NLS来促进与DNA的结合，这样转化效率明显提高^[14]。

充分利用静电相互作用来使NLS结合到DNA，这并不是要抑制DNA的NLS多肽结合位点，否则会干扰DNA的转录区域。核肽酸PNA可按特异序列的方式特异结合NLS肽到质粒DNA上，且不影响DNA的表达，这样可以使NIH/3T3细胞转化效率提高5-8倍^[15]。除了脊椎动物，NLS在甲壳纲动物中的功能也被证实为有效提高转化效率，DNA和NLS组非共价结合的转化效率在不同浓度DNA中是裸DNA的2倍以上；β半乳糖活性测定提示NLS的核输入速率比裸DNA要快得多，前者为20 min，后者为90 min，也有效避免了被DNA水解酶降解；且活性比后者高^[16]。

非共价结合的缺点是NLS可与质粒DNA在细胞内交换时发生解离，部分质粒DNA不能被NLS引导入核。为了预防或控制解离使NLS充分发挥核定位引导功能，采用共价结合的方式。DNA和NLS的共价结合主要也有三种方式：DNA和NLS之间通过化学活性相结合、DNA通过三次螺旋形式的寡聚核苷酸作为桥梁连接NLS、NLS作为帽子结构链接在线性DNA的两端^[11]。共价结合时主要关注避免把NLS结合到基因表达组件中，以免阻碍基因的表达^[17]；只有Zanta等^[18]把NLS-低聚核苷酸结合到线性DNA的一个末端或两端，其他实验中NLS共价链接是与基因载体相连。

Jeon等^[19]采用共价链接的方式取得了成功。研究中采用了广泛应用于基因转染的多聚纳米微粒聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA]，PLGA纳米微粒包裹质粒DNA，NLS共价连接该到纳米微粒上可以增强其基因转化效率。在人类皮肤成纤维细胞中的转化效率测试是采用纳米微粒包裹荧光素酶基因。与NLS共价连接后会增强其核定位或细胞摄取PLGA纳米微粒-质粒DNA复合物，增强该基因载体系统的转化效率。普通的质粒DNA从PLGA纳米微粒释放转化可持续9 d，但与NLS共价结合后提高其转化效率约1.2-3.2倍，可持续转染13 d以上。Carrière等^[20]共价偶联核输入蛋白β结合肽到质粒DNA，两者采用不同的比例结合，但转化效率仍然不高。而非共价结合核输入蛋白β结合肽(IBB)也能介导质粒DNA到核输入蛋白β，评价加入核输入蛋白结合肽(IBB)到DNA/阳离子脂质复合物后的转化效果发现，它可以将转化效率提高到20倍。但有意思的是偶联的NLS和DNA在显微注射注入胞质后并没有提高DNA的转化率，分析其原因可能是实验中DNA在胞质中被隔离而不能进入细胞核。这些研究表明，共价链接NLS到质粒DNA的方式在提高外源性基因的核输入和转化效率方面欠缺一定的稳定性，有待于进一步研究。

有研究在NLS介导质粒DNA的核输入时，在每千个碱基对加入25-100个NLS，当多于40个NLS已链接时，质粒DNA即可被转移入核，提示核定位信号的数量影响质粒DNA进入细胞核的效率和程度，其主要影响外源性DNA的核固缩^[21]。有效的核固缩对于细胞摄取、细胞内交换和细胞核摄入质粒DNA同样重要。DNA的核固缩可以由8个及以上的带正电荷的氨基酸来完成。有研究证实，天然NLS对DNA有压缩功能，可压缩DNA伸展的长链，提高其抵抗外力的能力，并且可以在胞质内促进内吞体逃逸，抵抗DNA水解酶的降解且具备粒径小、毒性小、转化率高等优点^[22]。有学者认为，只采用最小单位的经典NLS在增强转化效率方面是非常低的^[23]，另有研究合成4个完全相同的经典NLS，中间用甘氨酸残基相分隔的方式，组合多聚NLS肽链，可以将质粒DNA固缩成较小的复合物增加细胞核摄入质粒DNA和最终提高转化效率，与PEI/PLL等阳离子聚合物相比早期即可发生基因表达，转染2 h后质粒DNA可以在细胞核中被发现，提示该多聚NLS促进了基因的核输入^[24]。

核定位信号肽有多种类型，如经典的单一型、双分型、三分型、无定型……，尽管每种类型的核定位信号肽均可发挥转染外源性基因进入细胞核的作用，但关于不同类型的核定位信号肽对同一种目的基因转化效率的影响如何，目前还缺乏相应的对比研究，这也需要我们以后在实验中进一步证实。Dmitriev等^[25]研究证实，有两种不同类型的核定位信号均通过调节赖氨酸乙酰转移酶8(KAT8)的活性，共同作用于哺乳动物类的MSL1蛋白来调节H4K16组蛋白的乙酰化作用，但没有对两者的效率进行对比。

核定位信号的修饰调节主要包括磷酸化调节、抑制剂调节、乙酰化调节和锚定调节等。

部分NLS通常是包含在货物蛋白中的，蛋白质由于含有潜在的磷酸化位点，在细胞内相互作用的过程中可能会被磷酸化，如果这一位点位于NLS所在区域将会影响其与核输入蛋白结合，降低核输入效率；如果该磷酸化位点不与NLS所在区域重合，可能会提高NLS与核输入蛋白的结合效率，增强其介导的核输入^[23]。

真核细胞转录因子的Rel家族中重要的调节蛋白NF-κB也是一类特殊的核定位信号多肽，可促进质粒DNA入核。I-κB作为NF-κB的抑制蛋白，在细胞质中通常两者相结合，以失活的异源性二聚体的形式存在，从而抑制了外源性基因的核输入。在外源性细胞因子IL-1β的刺激下，通过蛋白激酶A使NF-κB磷酸化或通过蛋白激酶C使I-κB磷酸化，从而使两者发生解离，NF-κB的核定位信号得以暴露而被识别，进而可以促进转化^[26]。

也有研究表明将经典核定位信号肽的N端进行乙酰化作用后会增强其与寡聚核苷酸的结合和膜转位率从而提高转化效率^[27]。

有学者应用静电吸引法构建NLS-脂质体-DNA的三元复合体来进行基因转化，证明其具有增强DNA抵抗DNA酶的能力，从而提高DNA稳定性，并且在体内的转化效率也明显高于单纯的脂质体转染，且其细胞毒性也明显降低^[28]。

阳离子脂质体被广泛应用于几乎所有动物细胞，因为它无特异性，低毒性^[29]。但是在体实验时却发现其不够稳定，所以其他的阳离子聚合物如PEI、多聚赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)、阳离子树枝状大分子壳聚糖(chitosan，CS)被研究用于离体和在体实验^[30]。

也有采用聚乙烯乙二醇(polyethylene glycol，PEG)来增加阳性的NLS和阴性的DNA之间的距离。核定位信号肽的黏附数量和PEG的长度都对增强核输入蛋白α的结合和基因表达起重要的作用。偶联NLS通过分子质量3.4 kU的PEG间隔可使转化效率增加4倍。

作为一个多聚阳离子复合物序列，多聚赖氨酸已经作为一个DNA载体，它与SV40的大T抗原类似，可以靶向DNA入核，但是其它的研究没有证实这个假设。另一种方法是采用NLS与DNA序列和核固缩肽链接，采用多聚赖氨酸多肽，偶联到一个整合素靶向的三肽结合基序，其可以发挥刺激细胞黏附和靶向整合素到细胞膜的功能，这样可以使荧光表达量提高10倍。

NLS可以直接加入CS/DNA复合物，不必用共价链接的方式；与对照组(CS/DNA复合物、或NLS)相比，转化效率与NLS呈剂量相关。最高的转化效率出现在CS/DNA复合物质量比为4、NLS量为120 μg时，转化效率比对照组提高74倍。实验中虽然细胞毒性随着NLS增加而增强，但是存活率仍然维持在80%以上^[6]。提示这种实验方法具有低毒、高效的特点，值得在今后的研究中作进一步尝试。

核定位输入效率不理想的原因是DNA，或DNA/NLS复合物分子较大在细胞质内扩散能力较差、被胞质内核酶快速降解而不能达到核区入核而发挥作用^[31]。导致不能增强转化的原因可能是DNA分子太大很难通过核孔复合物。顺着这个思路，Zanta等^[18]偶联一个经典NLS到线性化的DNA上，该3.3 kb线性化DNA在尾端加了一个发卡样的帽子结构来阻止DNA在细胞内被核酸酶降解。这个NLS连接到该DNA发卡结构的3’端。与没有加NLS的线性DNA相比其转化效率提高了10到1 000倍。该增强的因素还涉及到使用的细胞类型有关。他们没有直接评价构建后的复合体的入核率，这么高的效率激励其他研究者来做类似的研究，但如果把NLS加到5’端时转化效率没有提高^[32]。然而众多实验结果不像该实验这么理想，提示转化效率可能与实验条件有很大的关系，而这些在最初看来可能微不足道。

包含NLS的多肽的离子残基也可与多聚阳离子相互作用用于DNA压缩或疏水性残基与脂质成分结合。NLS因此可以影响分子的理化性质，DNA的压缩效率，表面电荷的分布和细胞内的稳定性，这些最终都会影响转化效率。

随着N/P比例增加，CS/DNA复合物分子量和电荷相应的增加，因为CS和NLS都是带正电荷的，当N/P比在4时转化效率最高，提示不同的N/P对转化效率有着重要影响。以前的研究报告了pH值对CS的转化效率有影响，当pH值小于6.5时效率较高，当pH值增加到7.4时转化效率明显降低，可能与pH影响不同等电点CS和NLS的离子解离结合有关^{[6, 33]}。

总之，非病毒基因载体系统的成功与否将主要依据其转染非分化细胞的能力，通过细胞核的核膜将仍然是基因治疗效率的主要瓶颈。一些促进核输入并提高转化效率的策略只取得了初步的成功。可能有以下原因：①尽管NLS已经被广泛研究，但其介导质粒DNA的核输入机理仍然不够明确。②把报告基因表达作为转化的终点来评价NLS的作用大小，而不是NLS介导的核输入率。然而，转化效率往往被多种因素决定，很难评价NLS在其中所起到的作用。转化效率没有提高并不是意味着NLS没有发挥相应的作用。如共价结合NLS与DNA能明显提高核输入，但同时可能会阻碍报告基因的转录。③实验条件和细胞状态的不同导致评价NLS在转化效率中的作用困难。因此，标化实验方法来直接评价DNA-NLS的核输入作用非常亟需建立。