宫颈癌是危害女性健康的肿瘤之一，其发病率及死亡率在女性生殖系统肿瘤中位于前3位^[1]，转移是宫颈癌复发及预后不良的主要因素之一^[2]。寻找分子靶向治疗的靶点与药物是当下紧迫的任务。

Hedgehog(Hh)信号通路的异常激活参与包括宫颈癌在内的多种肿瘤的发生、发展^[3]，主要机制包括Hh配体依赖机制和非配体依赖机制^[4]。该通路是肿瘤分子靶向治疗药物研发的热门靶点，其末端转录因子Gli1的活化是此通路完全激活的标志。有研究表明^[5]，FoxM1是Hh通路的直接靶基因。FoxM1是叉头框(Foxhead Box，Fox)转录因子超家族主要成员，其主要生物学功能是调节细胞周期及有丝分裂^[6]。研究表明，在胶质母细胞瘤中，Gli1通过调控FoxM1的转录活性，从而增强癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力^[7]。Cyclin D1是调控细胞周期进展的正向调节因子之一，通过调控细胞周期的不同节点来促进细胞的有丝分裂，其表达受FoxM1的调控，是FoxM1的下游分子^[8]。本实验是在前期研究的基础上，用不同浓度Gli抑制剂GANT61作用于Hela细胞，探究其对Hela细胞的作用及相关分子机制，为宫颈癌的分子靶点治疗提供新思路。

人宫颈癌细胞系Hela购自武汉拜意尔生物技术有限公司，DMEM高糖培养基购自HyClone公司(美国)，胎牛血清购于杭州天杭生物科技有限公司(中国)，GANT61购于Selleck公司(美国)，Gli1抗体、FoxM1抗体、Cyclin D1抗体及GAPDH抗体均购于Abcam公司(美国)，HRP-山羊抗兔二抗购于武汉阿斯本生物技术有限公司(中国)，BCA蛋白质浓度测定试剂盒、细胞周期检测试剂盒购于天津三箭生物技术有限公司(中国)，CCK-8试剂盒购于碧云天生物技术有限公司(中国)，Transwell板(8 μm)购于Corning公司(美国)及Matrigel胶购于BD公司(美国)，Trizol试剂购于Invitrogen^TM公司(美国)，荧光定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司(日本)，逆转录引物采用Primer BLAST在线设计，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。

先用二甲基亚砜(DMSO)配制浓度为80 mmol/L的母液，溶解时50 ℃烘箱助溶，再用DMEM培养基稀释成相应浓度备用。

将人宫颈癌细胞系Hela培养于含10%胎牛血清，青-链霉素各100 U/ml的DMEM高糖培养基，37 ℃ 5% CO₂培养箱中孵育，取生长状态良好的对数生长期细胞进行实验。根据预实验检测的GANT61对Hela细胞活力半抑制浓度(IC₅₀)进行如下实验分组：0 (即含0.1%DMSO对照组)，20, 40及60 μmol/L。

取对数生长期Hela细胞，按5×10³/孔的密度接种于96孔板，加入含10%胎牛血清的培养基100 μl，置于37 ℃ 5% CO₂培养箱中培养24 h以贴壁。然后予细胞换液，加入不同浓度GANT61(终浓度为0，1，10，15，20，25，30，40，80 μmol/L)，以含0.1% DMSO培养基的细胞组为正常对照组和只含培养基组为空白对照，每组5个复孔。继续培养48 h后加入CCK-8溶液10 μl，避光继续培养1-4 h，酶标仪(DR-200Bs)测定450 nm处各孔光吸收值(OD值)，按公式计算药物对细胞的作用效果，存活率(%)=(实验组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)×100%；抑制率(%)=100%－存活率。SPSS统计软件计算GANT61抑制Hela细胞的IC₅₀值约为36.337 μmol/L，后续实验GANT61的浓度设置为0, 20, 40及60 μmol/L。

Hela细胞经GANT61(0，20，40，60 μmol/L)作用24 h，采用流式细胞仪检测细胞周期。细胞经PBS洗涤3次后离心(300 g，5 min)，弃上清，再缓慢加入预冷的90%乙醇重悬细胞，4 ℃孵育20 min后离心，PBS洗涤后加入500 μl RNAse/PI重悬细胞，避光染色20 min后选择相应通道上机检测，实验重复3次。

Hela细胞经GANT61(0，20，40 μmol/L)处理48 h，Trizol法提取总RNA，操作方法严格按照试剂盒说明书进行。采用PrimeScript逆转录试剂盒(含gDNA Eraser)合成cDNA。逆转录条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃备用。GAPDH作内源性标准化对照，每组样品作3个复孔。扩增条件：95 ℃预变性1 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，共40个循环。采用2^－ΔΔCt法计算目的基因mRNA的表达水平。实验重复3次。引物序列见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 引物的名称和序列 名称 序列(5′-3′) Gli1 F GTCCCACACCGGTACCACTG R AAGCATATCTTGCCCGAAGC FoxM1 F GCAGCGACAGGTTAAGGTTGA R TTGTGGCGGATGGAGTTCTT Cyclin D1 F TCGTGGCCTCTAAGATGAAGG R CACAGAGGGCAACGAAGGTC GAPDH F GGTCGGAGTCAACGGATTTG R 5GGAAGATGGTGATGGGATTTC

表 1 引物的名称和序列

Hela细胞经GANT61(0，20，40 μmol/L)处理48 h，严格按试剂说明书要求提取细胞总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，然后每孔上样量40 μg蛋白质进行SDS-PAGE分离，分离后的样品转移至PVDF膜，含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭1.5 h，加入兔抗人GAPDH单克隆抗体(1:10 000)，兔抗人Gli1(1:500)、FoxM1(1:500)、Cyclin D1(1:2 000)单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，然后将所述膜在室温下与HRP-山羊抗兔第二抗体(1:10 000)温育孵育30 min，TBST洗涤4次，ECL显影，Bio-Rad曝光系统暗室曝光。

用无血清培养基将Matrigel基质胶按1:3比例稀释，取50 μl加入Transwell小室中，置于37 ℃，5% CO₂温箱培养1 h，使基质胶凝固，迁移实验无此步骤。将Hela细胞饥饿处理12 h后按GANT61(0，20，40 μmol/L)分组，取1×10⁵/ml的单细胞悬液200 μl接种于含无血清培养基的上室，下室含10%FBS培养基，37 ℃，5%CO₂温箱培养24 h，取出小室，PBS洗去培养基，0.01%结晶紫染色10 min；洗除小室表面的结晶紫并用棉签轻轻擦掉上层未迁移/侵袭的细胞。100倍显微镜下随机5个视野观察细胞并拍照、记数。实验重复3次。

使用IBM SPSS 21.0软件进行统计学分析，各组样本均数比较均采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，所有实验数据均表示为均值±标准差；使用Graphpad prism 5.0软件绘图；P＜0.05表示差异有统计学意义。

采用CCK-8法检测不同浓度GANT61对Hela细胞增殖能力的影响。实验结果分析发现，GANT61对Hela细胞的生长表现为抑制作用，且该抑制效果呈剂量依赖性(P＜0.01)，其作用的IC₅₀值约为36.337 μmol/L，结果见图 1。

图 1(Figure 1)

图 1 CCK-8法检测不同浓度GANT61对Hela细胞活力的影响

各组细胞经GANT61处理后，采用流式细胞术检测细胞周期分布情况。如图 2所示，与对照组(0 μmol/L)相比，随着GANT61浓度的增加，实验组G₂/M期细胞比例增加(P＜0.01)，并可观察到当GANT61浓度为60 μmol/L时S期细胞比例增加，与对照组比较差异有统计学意义(P=0.033)，各组均未见明显的亚-G₁峰，结果见图 2。

图 2(Figure 2)

图 2 流式细胞仪检测不同浓度GANT61对Hela细胞周期的影响

荧光定量PCR结果显示，与对照组(0 μmol/L)相比，GANT61(20 μmol/L)组与GANT61(40 μmol/L)组的Gli1 mRNA、FoxM1 mRNA及CyclinD1 mRNA的表达水平降低(P＜0.01)，且随GANT61浓度的增加，其相应的mRNA表达水平逐步降低(P＜0.01)。Western Blot检测结果与荧光定量PCR数据分析基本一致，如图 3A所示，GANT61可剂量依赖性的降低Gli1、FoxM1及CyclinD1对应的蛋白表达(图 3)。

图 3(Figure 3)

图 3 RT-PCR及Western Blot检测GANT61对Hela细胞Gli1、FoxM1及Cyclin D1的mRNA水平与蛋白表达的影响 A：Gli1、FoxM1、Cyclin D1对应的蛋白表达水平；B：Gli1、FoxM1、Cyclin D1对应的mRNA水平

采用Transwell及Matrigel基质胶实验检测细胞的迁移及侵袭能力。各组细胞经GANT61作用后采用结晶紫染色，在倒置显微镜下观察并计数穿膜细胞数，结果如图所示。穿透小室膜的细胞数量按实验分组GANT61(0，20，40 μmol/L)分别为：迁移实验：303.67±12.89，208.67±5.51，123.33±17.62，组间比较差异均有统计学意义(P＜0.01)；侵袭实验：126.33±8.02，82.87±9.71，46.67±5.13，组间比较差异均有统计学意义(P＜0.01)(图 4)。

图 4(Figure 4)

图 4 Transwell实验检测GANT61对Hela细胞迁移及侵袭能力的影响(结晶紫染色×100)

我们的前期研究发现，在CIN Ⅱ/Ⅲ级宫颈组织和宫颈癌组织中，Hh关键成分Shh、PTCH1、SMO、Gli1等的表达明显高于正常宫颈组织^[9]，且在宫颈癌细胞系中，Hela细胞中Gli1与FoxM1的表达量均较其他细胞系高^{[6, 10]}，为便于观察现象，我们在前期研究的基础上，选用Hela细胞为本实验研究对象。

GANT61是由美国国家癌症研究所研发的Gli转录因子抑制剂，是近年来Gli靶点抑制剂的研究热点，可抑制Gli1的DNA结合能力^[11]，进而达到阻断Hh信号通路的目的。虽然SMO抑制剂维莫德吉(GDC-0449)和索尼吉步(SANT1)已被美国FDA批准上市并用于晚期基底细胞癌的治疗，但却因SMO突变出现了耐药^[12]。而Gli是SMO的下游靶蛋白，如果直接抑制Gli的表达，那么就可以从源头上解决目前SMO突变引起的耐药问题。Benvenuto等^[13]研究发现乳腺癌组织及癌细胞系中Hh通路高表达，用GDC-0449和GANT61分别作用于乳腺癌细胞系后，GANT61对乳腺癌细胞的生长抑制效果强于GDC-0449，并且可显著抑制乳腺癌原位移植瘤的生长，减少放疗抵抗。在本实验中，我们发现GANT61对Hela细胞生长的抑制作用呈剂量依赖性；GANT61对Hela细胞48 h的IC₅₀值约为36 μmol/L(见图 1)。由此可知，GANT61的确可以抑制Hela细胞的增殖能力。同时，我们用Transwell小室及Matrigel基质胶实验检测发现，GANT61能够剂量依赖性地抑制该细胞的侵袭及迁移能力(见图 4)。此外，本研究除了检测GANT61对Hela细胞常规生物学特性的影响，还探讨了该影响的具体机制，即通过抑制Gli1的表达，减弱FoxM1的核内转录活性，从而阻滞细胞周期的G₂/M期和S期进展。

FoxM1是通过调节细胞周期相关因子来推动细胞G₁/S期及G₂/M期节点的进程，促进细胞的增殖^[8]。Cyclin D1是受FoxM1调控的细胞周期中起关键作用的正向调节因子，特异性过表达于多种肿瘤细胞。多项研究表明，FoxM1除可调节细胞周期相关因子外，还可通过调节血管形成因子及EMT等来介导癌细胞的侵袭及转移^{[14, 15]}。本研究发现，GANT61可剂量依赖性的将Hela细胞周期阻滞在G₂/M期，当浓度达到60 μmol/L时，开始出现S期阻滞(见图 2)。因此我们推测，GANT61很可能通过影响细胞周期的进展来抑制Hela细胞的增殖。RT-PCR与Western Blot检测发现，随着GANT61浓度的增加，FoxM1与Cyclin D1的表达水平下降，该结果验证了我们的设想。

我们的前期研究发现，Gli1与FoxM1均高表达于宫颈癌组织^[9]，下调SiHa、Hela细胞系中Gli1的表达后，FoxM1的表达量同步降低^[16]。有研究表明^{[5, 7]}，FoxM1是Hh通路末端转录因子Gli1的直接靶标，其转录活性直接受Gli1的调控，且Gli1发挥作用需由FoxM1介导。在本研究中，当GANT61抑制Hela细胞中Gli1的表达后，FoxM1的mRNA水平和蛋白表达水平呈同步降低，且与细胞周期阻滞具有显著相关性。该结果验证了我们的设想，即在宫颈癌中，FoxM1是Hh通路末端转录因子Gli1的靶基因。

本研究表明，GANT61可有效阻滞细胞周期的进展，从而抑制Hela细胞的增殖、侵袭及迁移能力，为宫颈癌的分子靶向治疗提供了潜在的治疗靶点。