武汉大学学报(医学版)   2017, Vol. 38Issue (1): 112-114   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.01.027.
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引用本文 

罗涛. 肱骨骨折后异位骨化形成中BMP-2、BMP-9及TNF-α表达的变化[J]. 武汉大学学报(医学版), 2017, 38(1): 112-114. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.01.027.
LUO Tao. Changes of BMP-2, BMP-9, and TNF Alpha Expression in the Formation of Heterotopic Ossification After Humerus Fractures[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2017, 38(1): 112-114. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.01.027.

作者简介

罗涛, 男, 1974-, 医学硕士，主管技师，主要从事骨科骨折治疗和康复的研究

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收稿日期：2016-03-29
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肱骨骨折后异位骨化形成中BMP-2、BMP-9及TNF-α表达的变化
罗涛
武汉大学中南医院骨科 湖北 武汉 430071
收稿日期：2016-03-29
作者简介：罗涛, 男, 1974-, 医学硕士，主管技师，主要从事骨科骨折治疗和康复的研究
[摘要] 目的: 探究在肱骨骨折后，骨形态形成蛋白(BMP)-2、BMP-9及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达量对异位骨化过程中的影响。 方法: A组为肱骨折且合并严重软组织损伤，后期发生异位骨化病人的骨化标本，共17例；B组为肱骨骨折未合并严重软组织损伤，后期发生异位骨化病人的骨化标本，共15例；C组为肱骨骨折未合并异位骨化病人骨折附近的组织标本，共18例。用免疫组化法测定A、B和C组标本中BMP-2、BMP-9及TNF-α的表达量。 结果: BMP-2、BMP-9及TNF-α在A、B和C组均有表达，其中BMP-2，BMP-9及TNF-α在A、B和C组中的表达具有差异性(P < 0.05)，且BMP-9在A组和B组中表达具有差异性(P < 0.05)。 结论: BMP-2和BMP-9表达水平上调是肱骨骨折后异位骨化发生的重要机制，其中BMP-9只在骨折合并软组织损伤中发挥作用，而BMP-2在骨化过程中均发挥着重要作用，与软组织是否受损无关。TNF-α可以减缓骨化的发生，一定程度上抵消BMP-2和BMP-9所发挥的作用。
关键词： 肱骨骨折    异位骨化    BMP-2    BMP-9    TNF-α    
Changes of BMP-2, BMP-9, and TNF Alpha Expression in the Formation of Heterotopic Ossification After Humerus Fractures
LUO Tao     
Dept.of Orthopaedics, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China
[Abstract] Objective: To investigate the expression of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), morphogenetic protein-9 (BMP-9) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the formation of heterotopic ossification (HO) after humerus fracture. Methods: Group A consisted of 17 HO patients with original disease of humerus fracture and severe soft tissue injury. Group B consisted of 15 HO patients with original disease of humerus fracture and without severe soft tissue injury.Group C consisted of 18 humerus fracture patients without HO.Tissue specimens around the site of HO were gained in surgery and the expression of BMP-2, BMP-9 and TNF-α were detected by using immunohistochemical methods. Results: The expression of BMP-2, BMP-9 and TNF-α were all found in group A, B and C, and significant difference was also observed among these three groups (P < 0.05).Expression of BMP-9 was significantly lower in group B than that in group A (P < 0.05). Conclusion: High expression of BMP-2 and BMP-9 may be an important mechanism in development of HO after humerus fracture.BMP-2 plays a key role in the development of HO while BMP-9 only exerts its property in the process of HO with severe soft tissue injury. TNF-α may be a protective factor in the process of HO.
Key words: Humerus Fracture    Heterotopic Ossification    BMP-2    BMP-9    TNF Alpha    

异位骨化(heterotopic ossification, HO)是指在骨组织以外的地方发生骨化[1]。在临床上把并发手术或者继发于创伤的异位骨化称为创伤性骨化性肌炎(traumatic myositis ossificans, TMO)。严重的异位骨化可以影响肢体功能恢复，限制关节活动，甚至会造成关节强直，丧失关节活动功能。近些年来国内外研究人员对其进行了较多的研究，并对骨形态形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)在骨化过程中所起的作用及机制方面做了深入的探究[2, 3]。有研究者亦发现在骨化过程中，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)也扮演着重要角色[4-7]。本实验研究在骨化过程中BMP-2、BMP-9及TNF-α的表达量的改变及三者之间可能的关系，旨在为预防和治疗创伤后骨化提供理论基础。

1 资料与方法 1.1 临床资料

A组选取17例肱骨骨折且合并严重软组织损伤，后期发生异位骨化病人，男10例，女7例，年龄12-28岁，平均17.5岁；病历资料或体检发现在骨折发生时均合并有严重软组织损伤，因发生异位骨化而收入院。B组选取15例肱骨骨折未合并软组织损伤，后期发生异位骨化病人，男9例，女6例，年龄11-31岁，平均16.3岁；病历资料或体检发现在骨折发生时以及在恢复过程中无严重软组织损伤，但因发生异位骨化而收入院。C组选取18例肱骨骨折未合并异位骨化病人，男10例，女8例，年龄13-27岁，平均16.8岁，因单纯肱骨骨折而收入院。其中异位骨化的诊断标准为临床表现中出现在骨折周围局限性软组织肿胀或硬化包块或伴有关节疼痛以及关节活动范围下降；在影像学上表现为关节周围出现云絮状、条索状、斑块状或者不规则团块状钙化灶。骨折伴随软组织损伤程度的诊断标准和分级为G0：无或仅有轻微表皮擦伤；GⅠ：因骨折断端从内向外刺破软组织；GⅡ：污染的深度损伤，直接暴力所致局部皮肤肌肉挫伤，可伴有骨筋膜室综合征；GⅢ：广泛软组织挫裂伤、挤压伤或肌群毁灭、皮下分离。A组17例病人均符合GⅡ或者GⅢ标准，为骨折伴有严重软组织损伤；B组15例病人均符合G0或者GⅠ标准，为骨折不伴有严重软组织损伤。A、B和C组共40例病人，均无其它神经系统及心、肝肾严重疾病，无血液病，无糖尿病，无骨质疏松及成骨不全等基础疾病。

1.2 方法 1.2.1 主要实验试剂

骨形态形成蛋白2(BMP-2)抗体、骨形态形成蛋白9(BMP-9)抗体、肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体、显色剂等试剂均购自Sigma公司。

1.2.2 实验仪器

免疫组化制片仪、倒置显微镜。

1.2.3 实验方法

A、B组共32例病人在实行手术过程中，取骨化部位的标本，C组18例病人在实行骨折固定钢板取出术时取骨折端附近的少许组织标本[5-7]。将上述标本浸入10%多聚甲醛、石蜡包埋后作病理切片；按照免疫组化染色法(Envision法)予以染色。每张切片随机选5个视野(×400)，应用倒置显微镜观察并拍照，图像分析软件对每张照片进行BMP-2、BMP-9及TNF-α的表达的阳性细胞个数、区域大小测量，来判断是否是阳性。

1.2.4 数据分析

用SPSS 12.0软件进行检验及分析，组间数据比较采用卡方检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

A、B和C组的组织标本免疫组织化学检查结果见表 1。A组中14例病人(82.4%) BMP-2在靠近软管区附近的成纤维细胞中及骨化区域的软骨细胞中呈现阳性；16例病人(94.1%) BMP-9在靠近软管区附近的成纤维细胞中及骨化区域的软骨细胞中呈现阳性；3例病人(16.7%) TNF-α在未分化的血管周围细胞、软骨细胞的胞质及未骨化的纤维区域中呈现阳性。相应的，B组中，上述三个指标在主要观察区域的阳性例数分别为13例(86.7%)、2例(13.3%)和4例(26.7%)；而在C组中，上述三个指标在主要观察区域的阳性例数分别为2例(11.1%)、4例(22.2%)和23例(83.3%)。

表 1 BMP-2、BMP-9及TNF-α在各组标本中表达情况的比较[n(%)]
3 讨论

异位骨化的确切病因虽然尚不完全清楚，但目前主要认为与骨折发生时软组织损伤、手术操作刺激，局部出血、组织液渗出和炎性细胞浸润相关。Micha等人认为异位骨化的形成需要三个必须的条件：一定的诱因、成骨细胞和微环境[8]。然后再在各类活性细胞如巨细胞和骨生长因子如BMP-2、BMP-9等的共同作用下或者通过膜内化骨及软骨内化骨的诱导下，共同参与受损组织的修复，在吸收与分泌、沉聚与消散、控制与释放、涨与消的双向作用下损伤的软组织及血肿逐渐转化成骨组织，从而影响患肢功能，甚至导致肢体强直[9-11]。其中BMP是一种低分子量的疏水糖蛋白，通过转化间充质组织的遗传表达使其成为骨细胞，诱导异位骨化的发生，并促进羟基磷酸盐和钙的沉着[12]。Mukai等人在实验中发现TNF-α的表达可以显著的降低BMP-2碱性磷酸酶的活性，在骨分化的微环境中也发挥着一定的作用，能够减缓异位骨化的发生[12]。

本实验结果显示，A组即骨折且合并严重软组织损伤，后期发生异位骨化病人的组织标本中BMP-2和BMP-9的表达较C组增加，阳性细胞也增多，且差异显著(P < 0.05)，这表明在有软组织受损的骨折中，BMP-2和BMP-9的表达水平上调，并在异位骨化形成中大量表达，对骨化起重要诱导作用。而在B组即骨折未合并软组织损伤，后期发生异位骨化病人的组织标本中BMP-2的表达较C组增加，阳性细胞也增多，且差异显著(P < 0.05)，但是BMP-9的表达与C组相当，无差异显著，这表明在没有明显软组损伤的骨折中，只有BMP-2的表达水平是上调的，BMP-9的表达水平没有上调。且B组与A组相比，BMP-9的表达水平是下调的，差异具有显著性(P < 0.05)，这说明BMP-9只有在合并有软组织受损的条件下，才能发挥诱导骨化的作用，而BMP-2在各种微环境中都能发挥诱导骨化的作用。另外需要注意的是，A组和B组的TNF-α的表达与C组相比，是下降的，且差异显著(P < 0.05)，具有统计学意义，这表明在发生了异位骨化的病人中，TNF-α的表达是下调的，在没有发生异位骨化的病人中，TNF-α的表达是上调的，说明TNF-α在这其中起到了一定的保护作用，能够减缓BMP诱导骨化的作用。且观察到在A和B组中，当TNF-α的表达增加时，BMP-2的表达是下降的，即TNF-α的表达抑制了BMP-2的表达，表明在异位骨化的过程中，TNF-α是一种保护性因子。

目前，对于异位骨化发生的机制，主要集中于BMPs，尤其是BMP-2在异位骨化的过程中发挥着至关重要的作用，可刺激多潜能基质干细胞分化为成骨细胞，并能增强成骨细胞的功能[13-15]。BMP-9作为BMPs家族中的重要成员，在异位骨化过程中也发挥着一定的作用。本实验结果表明BMP-9只在合并有软组织受损的情况下，才能发挥其促进异位骨化发生的作用。TNF-α是一种由激活的巨噬细胞产生的抑制成骨细胞和刺激破骨细胞的细胞因子[17]。本实验结果也表明在发生了异位骨化的病人标本中，TNF-α的表达是下调的，在未发生异位骨化的病人标本中，TNF-α的表达是上调的。同时发现BMP-2和TNF-α是负相关的。这些都表明TNF-α在异位骨化的过程中作为一种保护性的细胞因子而发挥着作用。也为合理的预防和治疗异位骨化提供了一定的理论依据。

本次实验结果表明，BMP-2及BMP-9在异位骨化标本中表达上调，在诱导和维持异位骨化形成中起重要作用；BMP-2在合并或者不合并有软组织损伤的骨折中，均能发挥其诱导和维持作用，而BMP-9只能在合并有软组织损伤的骨折中发挥这种作用；TNF-α作为一种保护性细胞因子，在异位骨化的诱导和维持过程中，起着下调BMP-2表达的作用，对于预防和治疗异位骨化具有重要的意义。

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