特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一种持续进展的致命性肺部疾病，流行病学研究显示IPF全球年发病率为(2.8-9.3)/10万^[1]，且呈逐步上升趋势。该病发病机制不清，治疗手段匮乏。钙蛋白酶(calpain)是一种细胞内普遍存在的钙离子依赖的半胱氨酸蛋白水解酶，有研究证实钙蛋白酶参与肺纤维化的发生^[2]，但具体机制不清。蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)的活化可以促进肺纤维化的发生^[3]，且钙蛋白酶可以调节PKB ^[4]，因此我们猜测钙蛋白酶可能通过调节PKB参与肺纤维化的发生。

本研究通过博来霉素诱导小鼠发生肺纤维化，同时给予钙蛋白酶抑制剂(Calpeptin)干预，证实Calpeptin可以抑制钙蛋白酶的表达进而减轻肺纤维化，并探讨其可能的作用机制，为进一步寻找抗纤维化治疗靶点提供实验依据。

6-8周龄体重为20 g的SPF级雄性C57BL/6小鼠购于湖北省疾病预防控制中心；盐酸博来霉素注射液购自浙江海正药业；Calpeptin购自美国Calbiochem公司；calpain-1、calpain-2以及GAPDH抗体均购自英国Abcam公司；P-AKT(Ser473)和P-AKT(Thr308)抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。

将博来霉素溶解在生理盐水中，Calpeptin溶解在二甲基亚砜(DMSO)中。把C57BL/6小鼠编号后随机分为4组：生理盐水对照组(NS组)、博来霉素处理组(BLM组)、DMSO对照组(BLM+DMSO组)、钙蛋白酶抑制剂组(BLM+Calpeptin组)，每组10只。BLM组、BLM+DMSO组和BLM+Calpeptin组分别于第1, 5, 7, 11, 15天给予腹腔注射博来霉素溶液，NS组给予相应同等体积的生理盐水处理，其中BLM+Calpeptin组给予Calpeptin处理，BLM+DMSO组给予相应同等体积的DMSO处理。第28天后，20只小鼠行Micro-CT检测小鼠肺组织影像学改变，20只小鼠处死后取肺组织，左肺行HE染色分析肺组织病理改变并行纤维化评分，右肺提取蛋白后行Western Blot检测相应蛋白的表达水平。

将4组小鼠分别给予10%水合氯醛0.1 ml腹腔注射，麻醉完全后采用仰卧位摆放在Micro-CT扫描台上，固定参数后持续进行180 °扫描，扫描完毕后使用NRecon软件重建系统重建采样照片，观察每组小鼠肺组织变化情况。

小鼠处死后开胸取出完整肺组织，将左肺置于4%的多聚甲醛液中固定24 h后取出，脱水、包埋后切片，片厚约4 μm。然后将切片脱蜡、水化后按HE染色程序进行染色。在光镜下对HE染色切片作半定量分析，采用Ashcroft评分^[5]作为判定标准，将纤维化程度分为0-8级(级别越高，纤维化程度越重)。

将小鼠右肺用PBS液漂洗，充分剪碎后加入组织蛋白提取试剂，提取蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。然后将蛋白置于SDS-PAGE凝胶系统中电泳分离，用PVDF膜转膜后予TBST封闭，经一抗和二抗孵育后漂洗，加入ECL底物液，X光胶片压片，用BandScan分析条带灰度值。

所有数据采用SPSS 17.0统计分析软件进行统计学处理，应用Graphpad Prism5软件作图，所有数据以均数±标准差表示。两组间的比较用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

观察CT图像可见BLM组小鼠肺部中存在大量致密的纤维灶，主要位于胸膜下和气管旁。DMSO组小鼠肺部CT表现与BLM组小鼠无明显差异，而BLM+Calpeptin组小鼠纤维化有所缓解。表明博来霉素可诱导小鼠发生肺纤维化的影像学改变，而Calpeptin可以抑制肺纤维化影像学改变(图 1)。

图 1(Figure 1)

图 1 各组小鼠肺组织的影像学变化

与NS组小鼠相比，BLM组小鼠肺组织中可见到大量的中性粒细胞浸润，同时伴有明显的肺泡结构的破坏和肺泡间隔的增厚。DMSO对照组与BLM组相比无明显差异。BLM+Calpeptin组小鼠肺组织损伤程度较DMSO对照组有所缓解。Ashcroft评分结果显示与NS组相比，BLM组小鼠肺组织评分高(P＜0.01)，DMSO对照组与BLM组相比无明显差异(P>0.05)，而BLM+Calpeptin组纤维化评分较DMSO组明显降低(P＜0.01)。表明博来霉素可诱导小鼠发生肺纤维化的病理改变，而Calpeptin可以改善肺纤维化，降低纤维化评分(图 2)。

图 2(Figure 2)

图 2 Calpeptin对小鼠肺组织病理变化的影响 **P＜0.01，与NS组相比；##P＜0.01，与BLM+DMSO组相比；*P>0.05，与BLM组相比；比例尺=200 μm；n=5

Western Blot法检测各组小鼠肺组织匀浆中calpain-1和calpain-2蛋白的表达。与NS组小鼠相比，BLM组小鼠肺组织中calpain-1和calpain-2的表达升高(P＜0.05)，单纯给予DMSO干预后二者表达无明显变化(P>0.05)。给予Calpeptin干预后，calpain-1和calpain-2的表达较单纯给予DMSO相比明显下降(P＜0.05)。表明博来霉素诱导小鼠发生肺纤维化过程中，calpain-1和calpain-2表达增高，Calpeptin可以抑制calpain-1和calpain-2的表达水平(图 3)。

图 3(Figure 3)

图 3 Calpeptin对小鼠肺组织中calpain-1和calpain-2表达的影响 **P＜0.05，与NS组相比；#P＜0.05，与BLM+DMSO组相比；*P>0.05，与BLM组相比；n=5

为进一步研究钙蛋白酶在肺纤维化中的作用机制，我们检测了各组小鼠肺组织中蛋白激酶B的磷酸化水平。结果显示，BLM组的p-PKB (Ser473)和p-PKB (Thr308)水平相较于NS组明显升高(P＜0.05)，与DMSO组相比无明显差异(P>0.05)，而BLM+Calpeptin组中二者表达相较DMSO组明显下调(P＜0.05)。提示Calpeptin可能通过抑制蛋白激酶B的磷酸化，从而抑制博来霉素诱导的肺纤维化(图 4)。

图 4(Figure 4)

图 4 Calpeptin对小鼠肺组织中p-PKB的影响 **P＜0.05，与NS组相比；#P＜0.05，与BLM+DMSO组相比；*P>0.05，与BLM组相比；n=5

肺纤维化的病因尚未明确，研究认为与遗传因素和环境因素共同相关。吸烟^[6]、呼吸道病毒感染^[7]以及微生物的介入，损伤肺泡组织，释放多种炎症介质和细胞因子，通过胞内信号传导通路将信号传入细胞核，启动转录程序，引起肺成纤维细胞的异常增殖和细胞外基质的沉积，导致肺泡结构的破坏，纤维化形成。本研究通过博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型，给予Calpeptin干预后小鼠肺纤维化程度明显缓解，且calpain-1和calpain-2的表达水平下降。进一步发现calpeptin可以抑制肺纤维化肺组织中PKB的磷酸化水平，提示calpain可能通过促进PKB的活化参与博来霉素诱导的肺纤维化。

博来霉素是一种化疗药物，广泛应用于恶性肿瘤的治疗，可以导致人肺组织发生纤维化。博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型是目前用于研究肺纤维化应用最广的动物模型。1978年Snider等人^[8]发现肺纤维化与博来霉素之间存在剂量依赖相关性，单次给药可以诱导胸膜下区域发生短期的肺纤维化，而反复多次给药则可以诱导较为长期的肺纤维化^[9]，其特点与临床肺纤维化更为相似。因此，我们选用反复多次腹腔注射博来霉素诱导C57BL/6小鼠，成功构建小鼠肺纤维化模型，与Li等人^[10]的研究结果一致。

钙蛋白酶在哺乳动物细胞中普遍存在，随钙离子浓度变化激活，调控多种重要的细胞过程。既往对钙蛋白的研究主要集中在神经肌肉退行性变^[11]、癌症^[12]以及冠心病^[13]等，近几年发现钙蛋白酶也参与各种器官纤维化的发生^{[14, 15]}。Calpeptin是钙蛋白酶的选择性抑制剂^[16]。我们发现Calpeptin可以抑制calpain-1和calpain-2的表达，同时减轻博来霉素诱导的肺纤维化程度，与日本学者Tabata等^[2]的研究相符。此外，我们发现Calpeptin可以抑制PKB的磷酸化水平，证实了钙蛋白酶可以活化PKB参与肺纤维化的形成。有关于钙蛋白酶调控PKB的机制我们目前暂不清楚，可能与人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome10, PTEN)相关。PTEN是PKB的天然负向调节蛋白^[17]。有文献研究证明钙蛋白酶可以水解PTEN^[18]，降低PTEN的水平，从而可能增加PKB的磷酸化水平。

综上，我们发现Calpeptin可以缓解博来霉素诱导的纤维化，抑制肺组织中calpain-1和calpain-2的上调，并且我们还发现Calpeptin可以抑制PKB的磷酸化水平，表明calpain可能促进PKB的活化参与肺纤维化过程。