卵巢储备(ovarian reserve, OR)是指卵巢皮质区卵泡形成可受精卵母细胞的能力，包括卵泡数量和卵母细胞质量，反映女性的生育潜能。卵巢储备功能下降(diminished ovarian reserve, DOR)是指卵巢内存留的可募集卵泡数目减少及卵母细胞质量下降，表现出月经失调、月经稀发、闭经、不孕等症状，导致女性生育能力下降。临床指标表现为雌激素(estradiol, E₂)水平降低，促卵泡生成素(follicle stimulating hormone, FSH)水平升高, 抗苗勒管激素(anti-Mulerian hormone, AMH)水平降低，窦状卵泡数(antral follicle count, AFC)减少等。其发病率约占不孕症的10%，一般经1-6年可发展为卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)^{[1, 2]}。虽然目前体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)已成为治疗不孕症的常规方法，但DOR患者常表现为低获卵数、低妊娠率, 高周期取消率、高流产率，同时非整倍体发生风险也升高，严重影响了女性生殖健康。DOR的病因迄今不甚明了，可能与遗传、代谢异常、自身免疫性疾病、医源性损伤、感染、环境等多方面因素有关。近年来DOR发病率呈上升和年轻化趋势, 环境因素对生殖健康的影响日益受到人们的重视。研究显示^[2]，不良的环境因素可加速女性卵巢储备功能下降。

双酚A(bisphenol A, BPA)是环境内分泌干扰物(environment endocrine disruptors, EEDs)中一种典型的化合物，结构与雌二醇(estradiol, E₂)和己烯雌酚(diethylstilbestrol, DES)相似，具有一定的雌激素样作用及抗雄激素样作用。既往研究表明BPA可对小鼠青春期的起始、动情周期、生殖器官的生长与分化造成影响，并可影响卵细胞的成熟及减数分裂。本课题组前期研究^{[3, 4]}表明，BPA可干扰滋养细胞及颗粒细胞的生理功能。但目前临床上能证明BPA与DOR的发生发展有相关性的研究较少。基于此，本实验选择卵泡液这一相对理想生物样本，检测卵泡液中BPA浓度及激素水平，初步探讨BPA与DOR的相关性，以期为DOR的发生发展机制提供一定线索及临床证据。

选取2015年11月-2016年11月在武汉大学中南医院生殖医学中心接受常规体外受精(IVF)或卵胞浆内单精子注射(ICSI)治疗的DOR患者54例和非DOR患者67例(对照组)。

根据既往专家共识及相关文献^[5]，本研究采用以下诊断标准：① 血清AMH < 1.1 ng/ml；② FSH > 10 mIU/ml；③ E₂＜20 pg/ml或>80 pg/ml且AFC≤5，符合上述3条中的1条即可诊断。卵巢储备功能正常的定义是：① AMH > 2.0 ng/ml；② 基础FSH < 10 mIU/ml；③ 20 pg/ml≤基础E₂≤80 pg/ml且基础AFC > 5。同时符合上述3条。

实验组纳入标准：符合DOR诊断标准，知情告知后获得同意的患者。排除标准：不符合纳入标准者；近3个月内使用过性激素药物者；高催乳素血症、多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症患者、有卵巢手术史者；合并甲状腺或肾上腺等内分泌疾病者；不愿配合者。

对照组排除标准：纳入实验组的患者；近3个月内使用过性激素药物者；高催乳素血症、多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症患者、有卵巢手术史者；合并甲状腺或肾上腺等内分泌疾病者；不愿配合者。纳入标准：对照组排除标准之外的接受IVF/ICSI治疗的患者。

在阴道穿刺取卵(OPU)日，经阴道B超指引下穿刺取卵，留取清亮、无血染的卵泡液，酸洗玻璃瓶收集。离心后取上清液，－80 ℃冻存待测。

患者血清基础性激素[FSH、黄体生成素(LH)、E₂]水平均由我院检验科检测。卵泡液中BPA及相关激素采用ELISA试剂盒(武汉华联科生物公司)检测, 操作按试剂盒说明书要求进行。

采用SPSS 17.0软件分析。正态分布的计量资料采用t检验，结果以均数和标准差表示。Pearson相关分析研究连续变量之间的相关性。双侧a＜0.05为差异有统计学意义。

两组患者年龄、体质量指数(BMI)、初潮年龄、不孕年限、人流次数、基础LH和基础E₂均无统计学差异(P＞0.05)。DOR患者的基础FSH和FSH/LH显著高于非DOR患者(P＜0.01)。具体数据见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 患者一般情况对比表 项目 非DOR(n=67) DOR(n=54) P 年龄(岁) 34.550±4.557 35.040±4.860 ＞0.05 BMI(kg/m2) 23.170±3.760 23.230±2.200 ＞0.05 初潮年龄(岁) 12.240±0.800 12.220±0.880 ＞0.05 不孕年限(年) 3.410±2.940 3.040±1.704 ＞0.05 人流次数 1.190±1.360 1.350±1.443 ＞0.05 基础FSH(mIU/ml) 6.930±1.535 11.190±6.074 ＜0.01 基础LH(mIU/ml) 4.860±3.015 4.230±1.975 ＞0.05 FSH/LH 1.750±0.813 2.880±0.823 ＜0.01 基础E2(pg/ml) 36.910±20.130 40.790±18.82 ＞0.05

表 1 患者一般情况对比表

DOR患者的卵泡液BPA水平[(234.050±81.736) ng/L]高于非DOR患者[(193.300±67.225) ng/L], 差异有统计学意义(P＜0.01)。DOR患者的卵泡液中AMH和E₂水平低于非DOR患者[(555.690±74.224) pg/ml vs (587.180±77.731) pg/ml；(209.720±31.556) vs (221.850±32.632) pg/ml]差异有统计学意义(P＜0.05), 而卵泡液FSH及LH水平在两组中无统计学差异，如表 2。

表 2(Table 2)

表 2 卵泡液中各项浓度测量分析表 指标 非DOR DOR P BPA(ng/L) 193.300±67.225 234.050±81.736 ＜0.01 FSH(mIU/ml) 11.750±1.661 11.800±1.604 ＞0.05 LH(mIU/ml) 19.180±2.517 19.050±2.870 ＞0.05 E2(pg/ml) 221.850±32.632 209.720±31.556 ＜0.05 AMH(pg/ml) 587.180±77.731 555.690±74.224 ＜0.05

表 2 卵泡液中各项浓度测量分析表

在卵巢储备功能下降患者一般情况及基础激素各项指标中，卵泡液中BPA浓度水平与血清基础FSH具有正相关性，与年龄、BMI、初潮年龄、不孕年限、基础LH、基础E₂及FSH/LH无关。在卵泡液各项性激素中，卵泡液BPA浓度水平与AMH和E₂具有弱负相关性，与FSH及LH无关，见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 BPA与各指标的相关性分析 项目 r P 年龄 0.196 ＞0.05 BMI 0.111 ＞0.05 初潮年龄 -0.049 ＞0.05 不孕年限 0.147 ＞0.05 人流次数 -0.125 ＞0.05 基础FSH 0.306 ＜0.05 基础LH 0.193 ＞0.05 FSH/LH 0.219 ＞0.05 基础E2 0.010 ＞0.05 卵泡液   FSH -0.204 ＞0.05   LH -0.198 ＞0.05   E2 -0.290 ＜0.05   AMH -0.312 ＜0.05

表 3 BPA与各指标的相关性分析

双酚A(BPA)因可增加塑料制品性能，被世界范围内大规模使用。据统计，目前BPA的生产速度可达每年数千万吨。人可通过呼吸、饮食及皮肤接触摄入BPA。既往流行病学研究证明，BPA在人尿液、血清、卵泡液、乳汁、胎盘、羊水、唾液及脂肪中均可检测到，可对人体产生生殖毒性^[6]。通过既往研究可知BPA对动物及人卵巢卵泡的生成及激素的合成造成干扰，影响人的生殖能力。

通过与临床资料对比，我们发现DOR患者AFC数目较少，卵泡液中BPA浓度较高，由此推测卵巢局部BPA水平的升高可能降低了卵巢中AFC数目，这一结论与既往研究^[7]相符。既往研究^[8]发现，BPA可通过PI3K/Akt途径促进新生小鼠始基卵泡的过度激活，也可通过对下丘脑-垂体-卵巢轴的影响，使卵巢初级、次级卵泡数和闭锁卵泡数增加，窦卵泡数减少。同时我们发现DOR患者血清及卵泡液中AMH水平较低，而AMH由窦前卵泡和小窦卵泡中的颗粒细胞合成，我们推测BPA可能使卵巢AFC减少，使颗粒细胞活性降低及加速其凋亡，从而导致AMH的合成降低，进而表现为血清及卵泡液中AMH水平的降低。

由于DOR患者有较低的获卵数及获卵率，我们推测卵泡液中BPA水平的升高可能对这一现象产生一定的作用。既往动物实验表明，BPA可造成中心体蛋白的退化以及损伤纺锤体微管结构的完整性，从而使减数分裂期联会异常及染色体不能分布于赤道板上，最终导致减数分裂的停滞或异常染色体卵细胞及胚胎的形成。小鼠卵细胞染毒实验则表明，BPA对减数分裂纺锤体形成的损伤可能会导致卵细胞的死亡而非异常染色体的形成。这些研究表明，BPA可直接损伤卵细胞的发育，使卵细胞质量下降，从而导致卵母细胞受精能力及胚胎发育潜能下降，这一机制也许能很好解释BPA可降低DOR患者获卵数及获卵率这一临床现象。

我们发现DOR患者卵泡液中有较低的E₂水平，推测这可能与BPA水平的升高有关。既往动物实验表明^[9]，BPA的暴露，使颗粒细胞活性降低及停滞于G₂到M期的颗粒细胞增多，抑制甾体激素合成相关酶的合成，导致E₂激素合成减少。本课题组既往研究^[4]发现，BPA通过PPAR-γ途径影响P450arom表达从而抑制E₂的正常合成。流行病学研究结果显示，尿液中BPA浓度与行IVF女性患者血清E₂峰值负相关。综合以上研究结果及我们的临床实验结果，我们有理由推测，BPA通过对颗粒细胞的影响，造成低E₂状态，影响卵泡的生长发育和卵母细胞的成熟，表现为卵巢储备功能下降。

我们发现DOR患者血清基础FSH水平升高与卵泡液中BPA水平的升高有正相关性，但未发现卵泡液中FSH水平有差异，这可能是由于FSH水平在不同周期及同一周期的不同时间变化较大的缘故，需要进一步实验，同期检测血清及卵泡液中的激素水平，分析其相关性。

综上所述，BPA可在卵泡液中检测到，且卵巢储备功能下降患者卵泡液中BPA浓度相对偏高，同时伴有卵泡液中AMH和E₂的降低。我们推测卵巢局部微环境的变化对卵细胞及周围支持细胞造成损伤，降低卵巢储备功能，造成卵巢储备功能下降。本研究由于样本量较小及未考虑到的混杂因素，因此需要更严密设计、更大样本及多中心的实验研究来进一步验证这一结论。