钠-葡萄糖协同转运蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2，SGLT2)抑制剂是一种新型降糖药，通过抑制SGLT2，减少肾小管葡萄糖的重吸收及促进葡萄糖从尿液中排泄而降低血浆葡萄糖的浓度，被认为是糖尿病治疗的新希望^[1]。但SGLT2抑制剂促进尿糖排出，高尿糖诱导渗透性利尿，有发生容量丢失及电解质紊乱的风险^[2]。有研究表明血管紧张素Ⅱ受体抑制剂(angiotensin Ⅱ receptor blocker, ARB)可上调糖尿病肾髓质钠-钾-氯共转运蛋白(Na-K-Cl cotransporter 2，NKCC2)表达，增强肾髓质尿液浓缩功能。本实验拟联合运用SGLT2抑制剂达格列净和ARB坎地沙坦，观察其对糖尿病大鼠肾髓质尿液浓缩调节的影响。

链脲佐菌素(STZ)、达格列净购自Sigma公司，大鼠尿素转运蛋白-A1(urea transporter A1, UT-A1)、水通道蛋白2(aquaporin 2, AQP2)、NKCC2一抗由美国Emory大学肾病内科实验室提供。

36只清洁级Wistar雄性大鼠，随机分为正常对照组(N组，5只)及糖尿病组(15只)。糖尿病组给予一次性尾静脉注射STZ(60 mg/kg，溶于pH 4.2的柠檬酸缓冲液中)。24 h后，尾部静脉针扎取血检测随机血糖＞16.7 mmol/L，作为糖尿病动物模型建立标准。糖尿病组15只全部造模成功，随机分为糖尿病对照组(DM组，5只)、糖尿病+达格列净治疗组(DAPA组，5只)、糖尿病+达格列净+坎地沙坦治疗组(DAPA+CAN组，5只)。达格列净和坎地沙坦均通过灌胃每日一次给药，达格列净剂量为1 mg/(kg·d), 坎地沙坦剂量为2 mg/(kg·d)，连续用药7 d。实验期间动物正常饮食，自由饮水。于用药7 d后代谢笼收集24 h尿并处死动物，留取血、尿和肾组织标本进行指标检测。

血糖用葡萄糖氧化酶法检测。尿渗透压采用STY-3渗透压检测仪测定。血Na⁺、K⁺、Cl^-采用美国Medica Easylyte Plus全自动电解质分析仪检测。

① 蛋白样品准备：取肾组织，快速冰上分离获取肾皮质、外髓、内髓尖端和内髓基底部；蛋白裂解液匀浆肾组织提取蛋白；BCA法测蛋白浓度；以上样缓冲液和蛋白样品混合，滴定样品蛋白浓度为2 μg/μl；沸水煮沸2 min留存备用。②Western Blot检测：取蛋白样品，加入SDS聚丙酰胺凝胶每个点样孔中电泳，确定目的条带片段大小后，电印迹转膜，洗膜，脱脂奶粉封闭，丽春红染色确定各孔上样蛋白量相同，TBST洗涤，继之用大鼠UT-A1、AQP2、NKCC2一抗4 ℃过夜孵育，再用结合辣根过氧化物酶的二抗孵育2 h。③显影及定量分析：应用全自动分析系统显影，利用Kodak DS1D软件分析条带的积分吸光度值进行定量分析。

所有数据均以x±s表示, 组间比较采用方差分析和t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

达格列净治疗显著降低了糖尿病大鼠血糖浓度。糖尿病对照组和接受达格列净灌胃的两治疗组均出现明显的尿糖排泄，尿糖浓度显著高于正常对照组。与正常对照组相比，糖尿病大鼠出现多尿和尿渗透压下降，但达格列净治疗组24 h尿量明显低于糖尿病治疗组，达格列净+坎地沙坦治疗组24 h尿量较单用达格列净治疗组进一步下降，但均未达到统计学差异。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组大鼠血糖、尿糖、24 h尿量及尿渗透压变化 组别 血糖浓度(mmol/L) 尿糖浓度(mmol/L) 尿糖排泄率(mg/min) 24 h尿量(ml) 尿渗透压(mOsm/kg H2O) N组 8.2±0.4 4.0±0.2 0.48±0.04 18±2 1418±100 DM组 28.4±1.3* 513.3±22.8* 150.53±30.98* 135±19* 751±41* DAPA组 17.3±1.1*# 569.2±18.7* 159.91±9.52* 83±5*# 1067±31*# DAPA+CAN组 15.7±1.4*# 533.3±34.6* 153.29±15.15* 70±13*# 1189±154*# 与N组比较，*P＜0.05；与DM组比较，#P＜0.05

表 1 各组大鼠血糖、尿糖、24 h尿量及尿渗透压变化

与正常对照组相比，糖尿病对照组大鼠出现了低Na⁺、低K⁺及低Cl^-血症，两治疗组纠正了这种电解质紊乱，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 各组大鼠血Na+、K+、Cl-浓度变化 组别 血Na+浓度 (mmol/L) 血K+浓度 (mmol/L) 血Cl-浓度 (mmol/L) N组 138.9±0.5 6.5±0.3 103.7±0.5 DM组 130.6±1.7* 5.4±0.1* 95.4±1.3* DAPA组 138.7±1.0# 6.1±0.2# 104.4±1.1# DAPA+CAN组 137.3±1.3# 6.2±0.3# 103.4±0.9# 与N组比较，*P＜0.05；与DM组比较；#P＜0.05

表 2 各组大鼠血Na+、K+、Cl-浓度变化

与正常对照组相比，糖尿病大鼠肾组织内髓尖端UT-A1、AQP2蛋白表达明显升高，达格列净单用进一步上调了内髓尖端UT-A1蛋白表达。达格列净和坎地沙坦联用组不仅进一步上调内髓尖端UT-A1表达，外髓NKCC2蛋白表达亦进一步上调。见图 1。

图 1(Figure 1)

图 1 各组大鼠肾髓质UT-A1、AQP2、NKCC2蛋白表达变化 A：内髓尖端UT-A1蛋白表达；B：内髓尖端AQP2蛋白表达；C：外髓NKCC2蛋白表达。与N组比较，*P＜0.05；与DM比较，#P＜0.05;与DAPA组比较，&P＜0.05

糖尿病的发病率逐年升高，目前，世界上大约有2.85亿糖尿病患者，占世界人口的6.4%，预计到2030年，这一数字将达到4.38亿。降糖药物的研发一直是糖尿病研究领域的重中之重。SGLT2抑制剂通过抑制葡萄糖在近端肾小管的吸收，促进尿糖排泄，进而降低血糖，这一创新性的作用机制使SGLT2抑制剂降糖不依赖胰岛素作用，可以与其他降糖药联用，且其能降低体重，不增加患者心血管疾病的风险，被认为为糖尿病治疗带来了新希望。

然而，SGLT2抑制剂降糖作用通过增加尿糖排泄而实现，大量的尿糖排泄对机体是否造成影响，产生副作用，是学者们一直关心的问题。首当其冲的，即是大量尿糖排泄所致的渗透性利尿问题。在SGLT2抑制剂治疗2型糖尿病患者的临床试验中，有多篇文章都报道渗透性利尿相关副反应(直立性眩晕、直立性低血压、尿频、多尿)，但大多轻微，荟萃分析也未显示SGLT2抑制剂有增加2型糖尿病患者低血容量事件发生的风险^[3-7]。这提示我们SGLT2抑制剂可能调节糖尿病患者的尿液浓缩功能。另有研究表明ARB可上调糖尿病肾髓质NKCC2表达，增强肾髓质尿液浓缩功能^[8]。本实验单用SGLT2抑制剂达格列净或SGLT2抑制剂达格列净联用ARB坎地沙坦，观察其对糖尿病大鼠尿液浓缩的影响。

结果发现：单用达格列净，可使糖尿病大鼠血糖下降约40%，联用坎地沙坦，未进一步使血糖降低。关于尿糖排泄，未治疗糖尿病组、达格列净单用组、达格列净+坎地沙坦联用组三组水平相当。然而，在三组糖尿病大鼠间，类似的尿糖排泄未引起相同的渗透性利尿反应，达格列净单用组较未治疗糖尿病组24 h尿量明显减低，尿渗透压则明显增高。联用坎地沙坦进一步使24 h尿量减低，尿渗透压进一步升高。这提示我们在相同的尿糖排泄情况下，达格列净单用增强了肾脏尿液浓缩功能，联用坎地沙坦则进一步上调了肾脏尿液浓缩功能。

渗透性利尿可能导致电解质排泄增多，进而诱导电解质紊乱。我们观察了各组血Na⁺、K⁺、Cl^-浓度变化及其尿液排泄情况。结果表明：未治疗糖尿病大鼠出现了明显的低Na⁺、低K⁺和低Cl^-血症，单用达格列净或联用坎地沙均纠正了这种电解质紊乱。

我们继续探讨了达格列净单用或联用坎地沙坦对尿液浓缩相关蛋白表达的影响。尿液浓缩是一个复杂的过程，一些通道蛋白，在其中起关键作用^[9]。UT-A1位于肾脏内髓集合管，通过介导尿素从集合管管腔进入肾间质，维持内髓高渗；AQP2也位于肾脏内髓集合管，通过介导水的跨膜转运，直接导致尿液浓缩；NKCC2位于肾脏外髓，通过转运Na⁺、K⁺、Cl^-维持肾脏外髓高渗。有学者曾报道糖尿病大鼠肾组织UT-A1、AQP2和NKCC2表达增高，以适应性代偿高尿糖所致的渗透性利尿，避免大量体液丢失^[10]。本实验中，我们观察到：达格列净治疗大鼠肾脏内髓尖端UT-A1蛋白表达较未治疗糖尿病组进一步升高，联用坎地沙坦组肾组织外髓NKCC2蛋白表达较未治疗糖尿病组和单用达格列净治疗组进一步升高。这提示达格列净可能通过上调肾脏内髓UT-A1蛋白表达，坎地沙坦则通过上调肾脏外髓NKCC2蛋白表达，以调节高尿糖状态下肾脏尿液浓缩功能，二者合用则协同作用，对抗高尿糖所致的渗透性利尿效应。但达格列净上调UT-A1表达的机制并不清楚。而坎地沙坦诱导肾外髓NKCC2蛋白表达是否与坎地沙坦的抗氧化作用有关，也有待进一步研究。

综上所述，达格列净和坎地沙坦联用，通过上调肾脏内髓UT-A1和外髓NKCC2蛋白表达，增强尿液浓缩功能，减少高尿糖渗透性利尿效应，有利于防止糖尿病患者容量丢失和电解质紊乱。但达格列净和坎地沙坦通过何种机制分别诱导肾脏内髓UT-A1和外髓NKCC2蛋白表达，还值得进一步研究。