膀胱癌在常见肿瘤中发病率居第6位。2014年美国约有74 000例新发病例并有16 000例患者死于膀胱癌^[1]。我国2003-2007年膀胱癌男、女性年龄调整发病率分别为7.3/10万和2.0/10万，发病水平处于发达和发展中国家之间^[2]。大约70%的新发病例为非肌层浸润性疾病，这些肿瘤一般比较脆、容易出血，特征是容易原位或膀胱其他部位复发，与原始肿瘤级别相同或更高^[3]。约31%-78%肿瘤局限于黏膜或黏膜下层的患者5年内发生局部复发或出现新的尿路上皮 (移行细胞) 癌^[4]。由于肿瘤的异质性与肿瘤的不同生物学功能，到目前为止还没有比较准确的生物标记物来预测膀胱尿路上皮细胞癌的临床预后。

基质金属蛋白酶类 (matrix metalloproteinases, MMPs) 是一类分解细胞外基质蛋白的锌指金属蛋白家族^[5]。MMPs的活性通过改变细胞的微环境影响细胞的各种生物学功能，包括发育、创伤修复、炎症反应、血管生成与病理过程，例如牙周炎、关节炎、肿瘤细胞的侵袭与转移^[6]。MMP28，也被命名为epilysin，是基质金属蛋白酶家族的一个新兴成员，在结构上属于MMP-19亚家族，最早在角化细胞、睾丸中发现。在啮齿类动物中，MMP28在很多正常组织中有表达，如睾丸、小肠、皮肤和肺，表明它在组织内环境的平衡中起了关键作用^[7]。有研究者发现MMP28蛋白在一些肿瘤中的表达高于正常组织^[8]，然而也有研究表示在恶性肿瘤与癌细胞系中MMP28蛋白的表达是增加的^{[9, 10]}。不同的研究表明，MMP28在不同肿瘤组织的表达不一致。我们通过实时定量聚合酶链式反应 (qRT-PCR) 检测MMP28在膀胱癌组织与其配对的正常膀胱组织在mRNA的表达情况，并通过免疫组化检测MMP28蛋白在173例膀胱癌患者的表达情况，探讨MMP28与膀胱癌临床预后的关系。

8对新鲜的膀胱癌组织及其配对的正常膀胱组织经RNA Later处理。

收集2005-2008年武汉大学中南医院173例膀胱肿瘤库存标本蜡块，经4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片的厚度为0.4 μm。病理证实均为膀胱尿路上皮癌，且术前未经过治疗，收集患者的一般信息与随访资料。

用于qRT-PCR的MMP28的引物序列forward:5′-CTCATCCTCTTCAAGGGTG-3′, reverse:5′-GGAAGAAGATGATGGAGCCA-3′。GAPDH作为内参，引物序列为forward：5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′; reverse, 5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。RNA提取试剂Trizol、逆转录试剂盒购自英潍捷基 (上海) 贸易有限公司, 荧光定量PCR试剂SYBR购自Roche公司, 实时定量PCR仪购自BioRad公司。兔抗人MMP28多克隆抗体购自Abcam公司 (产品目录号：ab155507)。PBS、3%过氧化氢去离子水、二抗-HRP、DAB显色液均购于北京中杉金桥公司。

取1 μg RNA进行逆转录，反应体系 (共20 μl)：Reaction Mix 4 μl，Maxium Enzyme Mix 2 μl，模板RNA 1 μg，Water nuclease-free to 20 μl。反应条件：25 ℃ 10 min，50 ℃ 10min，85 ℃ 5 min，获得cDNA。将cDNA稀释10倍进行实时定量PCR。反应体系 (共15 μl) :SYBR 7.5 μl, 上、下游引物各1 μl, 模板5 μl, PCR水0.5 μl。反应条件:95 ℃预变性5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环, 实时定量PCR仪器自动绘制标准曲线及熔解曲线。

采用免疫组化两步法检测MMP28蛋白的表达。

经常规脱蜡、pH为6.0的柠檬酸抗原修复后，用3%过氧化氢去离子水封闭10 min。PBS清洗后，滴加一抗 (1:200，MMP28多克隆抗体)，4 ℃温育过夜。用PBS清洗后滴加二抗30 min，再次经PBS清洗后进行DAB显色。苏木素复染，封片。

实时定量PCR结果分析：采用2^-ΔΔCT法计算MMP28在膀胱癌组织与正常膀胱组织的相对表达量。

免疫组织化学结果：细胞质内见棕黄色颗粒为阳性。由2位资深病理医师在双盲法下独立评分。根据染色程度和染色细胞百分比进行评分。染色程度：基本不着色为0分；淡黄色为1分；黄色为2分；棕黄色为3分。按阳性细胞数量分为：阳性细胞数0%为0分；≤10%为1分；10%-50%为2分；50%-80%为3分；＞80%为4分。将着色程度与着色阳性细胞数相乘，6-12分者为MMP28高表达，0-4分者为MMP28低表达。

MMP28在膀胱癌组织与其配对的正常膀胱组织的相对表达用t检验。

采用SPSS 18.0统计软件分析，各组标本各观察指标的结果阳性率的比较采用χ²检验。MMP28高表达组与低表达组生存率的比较采用Kaplan-Meier法。相关性分析分别用单因素和多因素Cox回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

我们比较了8对新鲜膀胱癌组织及其配对正常膀胱组织中MMP28在转录水平上的表达，发现与配对的正常膀胱组织相比，膀胱癌组织中MMP28 mRNA的表达量明显增高。膀胱癌中MMP28的信使RNA是正常组织的2.3-7.9倍。如图 1所示。

图 1(Figure 1)

图 1 实时定量PCR检测膀胱癌组织与配对的正常组织中MMP28的相对表达 (T检验)

我们用免疫组化的方法检测173例膀胱癌患者石蜡切片中MMP28蛋白的表达量。结果表明MMP28主要在膀胱癌的细胞质中表达，如图 2。比较MMP28蛋白高表达与MMP28蛋白低表达的6个临床病理参数，T2-T4期的膀胱癌组织MMP28蛋白表达率明显高于Ta-T1期的膀胱癌组织 (χ²=8.949，P=0.037)；高级别的膀胱癌组织MMP28蛋白表达率高于低级别/中级别膀胱癌组织 (χ²=5.111，P=0.024)；年龄大于65岁的膀胱癌患者MMP28蛋白表达率高于年龄小于65岁的膀胱癌患者 (χ²=4.243，P=0.039)；MMP28的表达与患者性别、肿瘤大小和肿瘤数量无关 (表 1)。

图 2(Figure 2)

图 2 免疫组化检测MMP28在膀胱癌中表达 A和B：低表达；C和D：高表达；A和C：×200；B和D：×400

表 1(Table 1)

表 1 MMP28的表达与膀胱癌临床病理特点的关系 项目 n MMP28的表达[n(%)] P 低表达 高表达 性别 0.120  男 94 39(41.5) 55(58.5)  女 89 31(34.8) 58 (65.2) 年龄 (岁) 0.039  ≤65 80 39(48.8) 41(51.2)  >65 93 31 (33.3) 62(66.7) 病理分级 0.024  Ⅰ/Ⅱ级 106 50(47.2) 56(52.8)  Ⅲ级 67 20(29.8) 47(70.2) 肿瘤大小 (cm) 0.266  ≤3 90 40(44.4) 50(55.6)  >3 83 30(36.1) 53(63.9) 肿瘤数量 0.462  单灶 93 40(43.0) 53(57.0)  多灶 80 30(37.5) 50(62.5) 分期 0.003  Ta-T1 100 50(60.0) 50(40.0)  T2-T4 73 20(27.4) 53(82.6) 合计 173 70(40.5) 103(59.5)

表 1 MMP28的表达与膀胱癌临床病理特点的关系

应用Kaplan-Meier法分析MMP28蛋白表达对膀胱癌患者的总体生存率与无进展生存率的影响。结果表明MMP28蛋白的高表达与患者的总体生存率 (P=0.002) 和无进展生存率 (P=0.001) 下降有密切关系 (图 3)。我们建立Cox回归风险模型，单因素分析发现年龄 (HR=2.177，P=0.006；HR=2.166，P=0.007)、病理学分级 (HR=2.036，P=0.008；HR=2.084，P=0.006)、肿瘤数量 (HR=2.079，P=0.012；HR=2.046，P=0.013)、分期 (HR=2.622，P=0.003；HR=2.632，P=0.003)、MMP28蛋白表达 (HR=2.537，P=0.002；HR=2.645，P=0.001) 与患者的总生存率和无进展生存率有关 (表 2)。而且，多因素分析进一步发现除了肿瘤分期 (HR=2.148，P=0.022；HR=2.024，P=0.037) 外，MMP28(HR=1.932，P=0.043；HR=1.888，P=0.045) 是膀胱癌患者总体生存率和无进展生存率的一个独立预测因子 (表 3)。

图 3(Figure 3)

图 3 MMP28的表达与膀胱癌患者总生存时间和无进展生存时间的关系

表 2(Table 2)

表 2 膀胱癌总生存率与无进展生存率的单因素分析 预后因素 总生存率 无进展生存率 HR(95%CI) P HR(95%CI) P 性别 (男vs女) 0.772 (0.451-1.323) 0.346 0.760 (0.444-1.302) 0.318 年龄 (>65 vs≤65岁) 2.177 (1.244-3.801) 0.006 2.166 (1.237-3.792) 0.007 病理分级 (Ⅲ级vs Ⅰ/Ⅱ级) 2.036 (1.208-3.430) 0.008 2.084 (1.236-3.513) 0.006 肿瘤大小 (>4 cm vs≤4 cm) 7.467 (0.969-2.775) 0.065 1.621 (0.958-2.743) 0.072 肿瘤数目 (多病灶vs单病灶) 2.079 (1.178-3.670) 0.012 2.046 (1.160-3.610) 0.013 分期 (T2-T4 vsTa-T1) 2.622 (1.385-4.964) 0.003 2.632 (1.391-4.982) 0.003 MMP28(高表达vs低表达) 2.537 (1.365-4.713) 0.002 2.645 (1.423-4.915) 0.001

表 2 膀胱癌总生存率与无进展生存率的单因素分析

表 3(Table 3)

表 3 膀胱癌总生存率与无进展生存率的多因素分析 预后因素 总生存率 无进展生存率 HR (95%CI) P HR(95%CI) P 年龄 (>65 vs≤65岁) 1.755 (0.989-3.115) 0.055 1.722 (0.968-3.061) 0.064 病理分级 (Ⅲ级vs Ⅰ/Ⅱ级) 1.507 (0.875-2.594) 0.139 1.589 (0.926-2.727) 0.093 肿瘤数目 (多病灶vs单病灶) 1.436 (0.796-2.590) 0.230 1.432 (0.797-2.572) 0.229 分期 (T2-T4 vs Ta-T1) 2.148 (1.117-4.129) 0.022 2.024 (1.044-3.923) 0.037 MMP28(高表达vs低表达) 1.932 (1.020-3.659) 0.043 1.888 (0.987-3.611) 0.045

表 3 膀胱癌总生存率与无进展生存率的多因素分析

金属基质蛋白酶类 (MMPs) 家族是由23个结构上相关的酶组成，它重建和降解细胞外基质。同时，它能作用于非细胞外基质成分促进可溶性因子的释放，如生长因子和细胞外基质的细胞因子^[11]。很多研究表明在生理条件下，MMPs在胚胎形成和伤口愈合中起重要作用^{[9, 12]}，在病理条件下，如肿瘤的生长与转移、关节炎软骨的破坏和心血管疾病也与MMPs有关。

MMP28 (epilysin)，是一个相对分子质量为59 ×10³的蛋白，与MMP-19的关系较密切。有研究表明MMP28 mRNA在皮肤的基底和基底上部的角化细胞中、睾丸中发育的精原细胞和肺中高表达^[13]。在蛋白水平上，MMP28在肺、心脏、直肠、小肠和大脑中表达较高。在受伤的皮肤中，在伤口边缘处于有丝分裂的细胞MMP28的表达是上调的，但是在有迁移能力的角化细胞中，MMP28的表达并没有增加^[9]。Momohara等发现MMP28与免疫功能也有关，因为它在正常的循环T细胞中有表达并且在骨关节炎中的软骨中的表达量是上升的^[14]。MMP28在不同肿瘤中的表达情况是各有差异的^[15]。Bister等发现在直肠癌的形成过程中，MMP28的表达在肿瘤中是下调的，说明MMP28在维持细胞内环境的稳态起关键作用^[16]。然而，Lin等研究发现口腔鳞状上皮细胞癌中，敲除MMP28会引起细胞的生长减慢^[10]。在肺腺癌中，MMP28的高表达能诱导上皮细胞的上皮-间质转化 (EMT) 通过激活潜在的转化生长因子β(TGF-β) 通路^{[17, 18]}。

我们检测了MMP28在膀胱癌组织中的表达情况，并进一步阐述其临床意义。在8对新鲜膀胱癌组织及其配对正常膀胱组织中，膀胱癌组织中MMP28 mRNA的表达量是明显增高 (T/N=2.3-7.9, P＜0.05)。我们进而用免疫组化的方法检测173例膀胱癌患者中MMP28蛋白的表达，发现MMP28蛋白表达高的患者，其总体生存率与无进展生存率均差于表达低者 (P值均小于0.05)。用卡方检验探讨MMP28的表达及与膀胱癌临床病理特征的关系，结果表明MMP28的表达与患者的年龄、病理分级与肿瘤分期有关。而且，多因素回归分析发现MMP28的表达高是膀胱癌的一个独立预后因素，无论是总体生存率还是无进展生存率。

总之，我们研究证明MMP28在膀胱癌患者的生存和进展中起重要作用，并为通过靶向MMP28而改善患者的生存提供临床依据。