移植是治疗终末期疾病唯一有效的手段，因而脏器保存技术也应运而生。目前国际上普遍使用的脏器保存技术分为单纯冷保存和机械灌注保存两种，单纯的冷保存操作简单，保存时间可达24 h，基本满足了脏器保存的需要。然而，供需失衡严重制约移植技术发展，近10年来，边缘供体越来越多地应用于临床，这些供体器官热缺血损伤更严重，对冷缺血更敏感，术后多发并发症。因此，研究新的脏器保存手段来提高供体质量，减少移植术后原发性无功能和移植物功能延迟恢复等术后并发症迫在眉睫。对于新型器官保存手段低温机械灌注备受研究者的关注。本文就低温机械灌注的研究进展作一综述。

1 机械灌注的基本方式与分类

机械灌注保存技术是指在保存过程中持续向脏器泵入保存液直至移植，它尽量模拟生理状态下的脏器灌注来减轻保存过程中所引起的脏器损伤，其根据需氧气与否可分为携氧机械灌注(hypothermic oxygenated perfusion，HOPE)和非携氧机械灌注；根据温度的不同可分为低温机械灌注(hypothermic mechanic perfusion，HMP)和常温机械灌注(normothermic mechanic perfusion，NMP)，其中低温氧合机械灌注具有较良好脏器保存效果。随着我国器官捐献移植的开展，边缘供体数量的增多，机械灌注有希望成为修复和评估供肝的有效手段。但具体的灌注参数、适应证还需进一步的探索。

2 机械灌注方法的保存机制 2.1 低温机械灌注的保护机制

低温保存是基于降低代谢率和减少氧需求的原理，在此基础上，HMP通过持续低温灌注一方面可以持续保持脏器低温，另一方面也可以通过去除废物、冲洗脏器中残存血液、微小血栓以及为脏器提供代谢底物，达到保存及修复供脏器的目的^[1]。同时灌注系统可以提供灌注液中生化指标变化为评估供体质量提供客观指标^[2]。

低温可以减慢细胞代谢活动，而低温机器灌注可以在冷缺血期间调节大部分细胞代谢的缺失成分，因此低温机械灌注可以有效降低新陈代谢水平及异化作用^[3]；ATP代谢的代谢底物可以不断循环，直接通过内皮-实质接触的“洗出”废物；同时机械灌注提供营养，能清除自由基以及减少细胞水肿，从而降低缺血再灌注(IR)相关的损伤，提高器官保存的质量^[4]。此外，机器灌注保存对于微循环的改善更佳，在灌注过程中可以给予供氧、能量供给、ATP的补充，并可以及时进行有毒物质的清除，及时评估肝脏的可用性等^[5]。同时，一项关于肾移植的研究显示，与单纯低温保存相比，机械灌注有助于移植物功能恢复，减少迟发型移植物失功的发生率^[6]。

Guarrera等^[7]使用心脏死亡供体(DCD)供肝做了临床实验，20名成人接受了HMP保存的肝脏，并与Celsior(CS)液保存的肝移植的匹配组进行了比较。HMP组在移植前给予3-7 h的冷保存，然后进行低温灌注。CS组移植前同样给予冷保存3-7 h。结果发现机械灌注组移植物早期功能恢复顺利，早期无功能率(early allograft dysfunction)仅为5%，而CS组为25%(P=0.08)。术后肝功能指标峰值[丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TB)]较低，恢复至正常时间较短。术后HMP组仅有2例发生胆道并发症，而CS组有4例。同时住院时间HMP组均比CS组短。初步证明了HMP的临床可行性和安全性。同时发现，HMP可减少氧化标记物[缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)1α、ARNT、超氧化物歧化酶(SOD)]、C反应蛋白，以及各种炎症因子(TNF-α，IL-1，IL-6)的生成，减少非特异性炎症反应，减少肝细胞凋亡。

Chatauret^[8]等在猪肾移植中发现，HMP可以保护内皮细胞功能，对于边缘肾脏的保存效果较好。然而，这一假设仍有待临床前模型进行测试。他们发现HMP可以保护一氧化氮(NO)信号通路，内皮通过增加的内皮NO合酶(eNOS)表达(KLF2依赖性)或通过磷酸化(通过Akt，PKA或AMPKα)激活eNOS来释放血管扩张剂NO，从而减轻血管痉挛。还有研究显示HMP后可以使KLF2及其血管保护程序的表达降低，从而预防肝损伤、炎症和氧化应激，改善内皮功能障碍^[9]。

此外，还有研究是调查基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达与肾脏缺血再灌注损伤后冷藏(CS)或DCD的HMP模型的炎症反应之间的相关性。取新西兰白兔肾脏经受35 min的热缺血和1 h再灌注，然后通过1 h再灌注(假手术组)，4 h CS或4 h HMP体内保存。肾脏24 h再灌注，进一步分析。正常对照组不给予治疗。结果，与CS组相比，HMP组MMP-9和NF-κB mRNA表达下调，SOD活性升高，TNF-α，IL-6，MDA和MPO活性降低，表明炎性细胞因子介导MMP-9通过NF-κB表达MMP-9启动子区域，导致肾损伤。因此，HMP可能通过下调MMP-9的表达来减少炎症反应，保护肾脏^[10]。

White^[11]等在研究DCD心脏灌注的实验中发现，CS后的DCD心脏导致细胞内钙超载和超负荷钙离子通过，钙依赖性蛋白酶的激活，活性氧的产生，线粒体通透性转换孔(MPT)的活化，ATP合成终止和凋亡途径的启动引起的心肌细胞死亡的传播。然而在HMP中，向灌注溶液中加入氢氧化钠交换抑制剂或抗氧化剂可以减少缺血再灌注损伤并优化功能恢复；加入促红细胞生成素、三硝酸甘油酯、p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂等药剂也可以使得DCD心脏复苏。综合来看，这些研究表明，HMP灌注可以进行药物干预减轻缺血再灌注损伤，恢复心肌能量储存和恢复离子稳态，进而减轻DCD心脏的损伤。

2.2 低温携氧机械灌注

HOPE技术的一个吸引人的特征是在常规冷冲洗和器官运输(局部缺血灌注)之后易于应用，从而避免了灌注设备繁琐的运输。与正常体温灌注策略相反，HOPE技术可以在生理条件下预先输送氧合血液来避免任何冷藏期，可逆地抑制冷冻保存后的线粒体氧化代谢，减少再灌注后活性氧物质的线粒体释放，许多细胞内和细胞外途径的减少，包括宿主炎症反应^[12]。

低温携氧机械灌注的保护机制至少有两点：首先，低温机械灌注本身，在前文中已经提到，可以独立于氧气，防止内皮损伤及炎症因子释放等。第二，在低温状态下，肝脏的生理代谢率下降，HOPE中含氧的目的并不完全是提供足够的氧合需求，更重要的是转变代谢模式，将无氧代谢转变为有氧代谢。

Dutkowski^[13]等人对人的DCD肝脏进行了植入前的HOPE治疗，结果显示，未灌注的DCD、DBD肝脏和HOPE治疗后的DCD肝脏三者对比：移植手术的持续时间(5.8 vs 6.2 vs 5 h)，重症监护室(3 vs 4 vs 4 d)和住院时间(18.5 vs 18 vs 11 d)，还有1年移植生存期(93%vs 90%vs 90%)。因此，HOPE治疗的DCD肝脏可减少初始再灌注损伤，导致更好的移植功能和预防肝内胆道并发症。已有研究表明HOPE是防止胆汁损伤的有利策略^[14]。此外，HOPE方法还能延迟肝组织形态学变化和细胞凋亡率，保护肝组织的代谢活性^[15]。大量动物实验也已经证明HOPE可有效减轻缺血损伤。其机制如下：

有研究表明^[16]，HOPE可以降低柠檬酸循环中间体琥珀酸的选择性积累和氧化，清除代谢废物，降低线粒体活性氧(ROS)的产生，提高细胞内ATP的含量。

进一步对HOPE中线粒体ROS及下游介质的研究表明，HOPE可能通过线粒体修复机制阻止植入过程中的氧化应激^[17]。HOPE由于线粒体氧化还原状态的改变从而降低了线粒体ROS释放。已有研究显示线粒体是氧化应激的来源^[18]，HOPE因而阻止了初始氧化应激，也阻止了相关下游炎症介质因子和核因子的释放，从而可以减轻再灌注损伤。

Schlegel^[19]等人取大鼠肝脏在移植前进行1 h HOPE，发现HOPE治疗后Kupffer细胞(KCs)和内皮细胞活化减少，肝移植后T细胞浸润减少，血液循环和活化T细胞数量减少明显。其具体机制为：HOPE可以减少核损伤，抑制细胞中活性氧产生，而损伤相关的分子模式(DAMPs)的产生取决于细胞内ROS的量^[20]，从而抑制HMGB-1，TRL-2，TLR-3，TLR-4，TLR-7，TLR-9和晚期糖基化终产物(RAGE)受体的释放^[21]，最终导致炎症因子相关的趋化因子释放减少。Kupffer细胞和树突状细胞(DCs)通过产生炎症环境来响应DAMP，该炎症环境也激活了T细胞，单核细胞和中性粒细胞的流入和激活，从而激活中性粒细胞螯合^[22]，通过几种途径进一步下游肌成纤维细胞的激活刺激移植物纤维化和肝内胆管细胞增殖的发展^[23]。HOPE证实可以免受这种类型的再灌注损伤，同时能影响免疫应答在肝脏微环境中的分子效应，防止免疫反应途径激活，减少肝细胞坏死^[14]。

此外，Lüer^[24]等人取大鼠DCD肝脏，分为三组：100%氧气(HMP100)，空气(HMP20)或完全没有氧化即HMP进行灌注，结果显示：AMPK通常被激活作为由细胞和环境压力引起的升高的AMP/ATP比例的早期反应，而100%的氧合作用可以防止缺血/再灌注期间AMPK激活的下降。AMPK磷酸化的细胞保护作用的分子机制包括激活p38 MAPK信号通路和刺激自噬。自噬使细胞不仅可以回收氨基酸，而且可以去除受损的细胞器，从而消除氧化应激，并允许细胞重塑进行生存。同时，AMPK的上游活化也可通过cAMP-PKA途径独立发生。已有实验已经表明，低温氧合对cAMP-PKA信号通路的有利作用，而此信号通路有助于改善肝活力。

3 总结

目前临床上普遍使用的方法为冷保存，但随着临床开始关注扩大标准供肝的应用，其缺点越来越暴露出来，能导致术后移植物功能不良及微循环障碍等并发症发生率增高等问题。

而低温机械灌注保存方法具有以下优点：①更大的保存范围：老龄供肝、DCD供肝、脂肪肝等，尤其是对于DCD供肝的保存显示了较好的保存效果；②更好的肝功能及微循环状况：术后原发性肝无功能及微循环障碍等并发症的发生率较低；③更好地减轻缺血再灌注损伤：在灌注过程中可以供氧、补充ATP或药物，并可以及时进行清除代谢废物；④还可以缩短住院时间，降低医疗成本^[25]。低温机器灌注保存方法的优势决定其很可能比目前低温保存方法有更强的生命力。但是，目前机械灌注保存的研究仍处于动物试验阶段，仍然有许多实际问题需要解决，如设备的便携性、HMP、HOPE的作用机制、优异的质量评估指标、灌注液的氧合问题等仍需要更多更广泛的临床试验来验证其临床效果。