干眼是一种多因素引起的泪膜不稳定，导致角结膜上皮细胞损伤的疾病^[1]。炎症介质IL-1和TNF-α表达上调，从而激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路引起一系列改变，导致干眼的发生^[2-6]。MAPK是哺乳动物细胞内最重要的信号传导通路，细胞运用这一系统将细胞外刺激信号传递到细胞核内，介导细胞产生反应。丝裂原活化蛋白激酶-细胞外调节蛋白激酶(MAPK-ERK)通路具有信号放大功能^{[9, 10]}。

氟西汀是最常见抗抑郁药物，为5-羟色胺重摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitor, SSRI)，本研究小组对2009-2015年我院收治的抑郁症患者进行干眼调查分析，结果显示接受SSRI治疗可显著增加干眼症。SSRI通过介导参与MAPK-ERK发挥抗抑郁作用，而另一方面SSRI激活MAPK-ERK通路引起炎症细胞因子IL-1β、TNF-α增加，从而引起的眼部表面炎症^[11]。本研究通过检测不同浓度盐酸氟西汀对体外细胞学生物行为的影响，并通过对角结膜上皮细胞MAPK-ERK信号通路中ERK、P-ERK，以及炎性因子IL-1、TNF-α的检测，以期探讨抗抑郁药引起干眼疾病的发病机制。

取健康成年人结膜组织原代培养结膜上皮细胞(HConEpiC)，结膜组织由武汉大学人民医院眼科中心提供。低糖DMEM培养基由武汉博士德公司生产，胰蛋白酶、EDTA由上海化学试剂厂生产，CK13由DACO公司生产、Trizol试剂由美国GIBCO公司生产；氟西汀购自美国Sigma公司，以人结膜上皮细胞培养基为溶剂配制相应浓度的氟西汀；CCK-8细胞增殖试剂盒购自南京建成生物工程研究所；鼠抗人ERK1/2单克隆抗体、鼠抗人P-ERK1/2单克隆抗体购自Upstate公司；鼠抗人TNF-α单克隆抗体、鼠抗人IL-1β单克隆抗体购自OriGene公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(二抗)购自博士德公司；ECL发光试剂购自Pierce Chemical公司。

结膜上皮细胞的培养:采用混合消化液培养法。取健康成年人结膜组织, 分离去除上皮下纤维组织, 经常规消毒处理后, 置于培养皿中, 用眼科小剪刀将其剪碎, 然后加入混合消化液, 37 ℃温箱消化10 min, 经应用液终止消化后进行吹打, 并吸走絮片状组织块, 将细胞悬液作800 r/min离心6 min, 弃去上清液, 再次加入应用液, 把细胞吹匀, 并按(4-6) ×10⁴个/ml的细胞密度接种于培养瓶, 按常规方法培养, 3-4 d换液1次。日常于倒置显微镜下观察细胞的生长状况, 细胞单层融合后传代, 取第2-4代细胞进行实验。细胞鉴定：倒置显微镜下观察细胞的生长状况, 并作显微照像。免疫组化:将第二代细胞接种于培养皿中的盖玻片上, 当细胞基本融合时取出, 4%多聚甲醛固定2 h, CK13染色, DAB显色, 最后将盖玻片反扣在载玻片上, 封固观察。

选择生长良好的第3代HConEpiC接种于96孔板中，每孔100 μl，置于5% CO₂、37 ℃培养箱中，孵育24 h后加入不同浓度氟西汀(0，1，2.5，5，10，20，40 μmol/L)，于37 ℃培养箱中作用24 h，每个浓度梯度设置3个复孔。检测时吸出培养基，每孔加入不含胎牛血清的DMEM培养液100 μl及10 μl CCK-8，CO₂培养箱中孵育2 h，用酶联免疫检测仪测定450 nm的累积光密度(IOD)值，换算为细胞增殖率。细胞增殖率=(后IOD-前IOD)/前IOD× 100%。依据细胞增殖率选择适宜氟西汀浓度用于后续实验。

将对数生长期的细胞种植在明胶包裹的盖玻片上，4%多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗5 min×3次，1% TritonX-100破膜10 min，PBS漂洗5 min×3次。应用1%牛血清白蛋白室温阻断1 h后，一抗(1：100于1%牛血清白阻断液)4 ℃孵育过夜。经PBS溶液清洗3次后，二抗(1：100于1%牛血清白阻断液)室温孵育1 h。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染核15 min后PBS漂洗5 min×3次，甘油封片后荧光显微镜下观察并拍照，其中蓝色荧光为DAPI标记的细胞核，红色荧光为目的蛋白ERK1/2、P-ERK1/2、IL-1、TNF-α表达。

对照组与氟西汀组(5 μmol/L)的细胞培养24 h后，分别提取细胞总蛋白，并用Western Blot实验检测各组ERK1/2、P-ERK1/2、IL-1、TNF-α蛋白的表达水平，将20 μg细胞蛋白或20 μl免疫沉淀物和上样缓冲液混合后，上样在10%分离胶/5%积层胶上进行SDS-PACE。应用电转移将电泳分离后的蛋白转移至硝酸纤维素滤膜上。滤膜经5%脱脂奶粉-PBS溶液于室温封闭1 h后，一抗孵育过夜。滤膜经PBS缓冲液清洗3次后，再与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)交联的二抗于室温孵育1 h。滤膜经PBS缓冲液清洗3次后，应用增强的化学发光法(enhanced chemiluminescence, ECL)显影。BandScan软件分析胶片灰度值，用Excel对数据进行统计学处理。

实验数据以x±s表示, 用SPSS 12.0软件处理数据, 用方差分析进行组间比较, 各组数据之间的两两比较采用q检验, 以P＜0.05为差异有统计学意义。

倒置显微镜下观察发现，复苏后的人结膜上皮细胞在0.5 h后开始贴壁生长，此时细胞呈圆形，胞体肥大、透亮，细胞核位于中央，胞膜清楚，1 h后细胞开始向周边移行，24 h后细胞几乎完全贴壁，此时细胞呈多边形，单个或小团块生长，CK-13免疫荧光检测可见绝大部分细胞胞质内CK-13阳性表达，证实所培养的细胞为HConEpiC，细胞培养及CK-13免疫荧光照片见图 1。

图 1(Figure 1)

图 1 倒置显微镜下的传代培养的人结膜上皮细胞 A：示细胞CK-13阳性表达(×400)；B：示细胞传代培养后生长良好(×100)

向HConEpiC细胞中加入不同浓度氟西汀(0, 1, 2.5, 5, 10, 20, 40 μmol/L)孵育24 h后，CCK-8检测结果显示，氟西汀对HConEpiC细胞具有一定毒性作用，随浓度增高，HConEpiC细胞增殖率逐步降低，在氟西汀浓度分别为1, 2.5, 5 μmol/L时，增殖率呈缓慢降低状态，分别为对照组的(94.34±4.52)%、(92.25±3.84)%、(87.12±3.28)%，在氟西汀浓度为10 μmol/L时，细胞增殖率则表现为明显降低状态，为对照组(0 μmol/L)的(72.26±2.84)%，表明此时氟西汀已对HConEpiC细胞有明显的毒性作用(见图 2)。因而我们选择氟西汀浓度为5 μmol/L用于后续实验。

图 2(Figure 2)

图 2 不同浓度氟西汀对细胞活性影响

各检测指标在细胞中的定位见图 3-6，从图中可以看出，ERK 1/2及P-ERK1/2主要表达在细胞核中，IL-1主要表达在细胞膜中，TNF-α主要表达在细胞膜及细胞间质中。使用IPP 6.0软件对氟西汀组与对照组的细胞免疫荧光照片进行光密度分析发现(氟西汀与对照组分别随机抽取200倍镜下的细胞免疫荧光照片2张及400倍镜下2张进行分析)，氟西汀组与对照组相比，氟西汀组ERK1/2的IOD值(232 439.5±54 956.9)较对照组(228 261.2±47 734.6)差别不大，差异无统计学意义(P＞0.05)，提示氟西汀干预对HConEpiC中ERK1/2蛋白的表达无明显影响；氟西汀组P-ERK1/2的IOD值(243 125.9±26 729.5)较对照组(151 396.0±29 759.9)明显增高(P＜0.05)，提示氟西汀干预后HConEpiC细胞中P-ERK1/2蛋白表达增多；氟西汀组IL-1的IOD值(228 458.8±26 736.0)较对照组(167 831.3±30 432.7)增高(P＜0.05)，提示氟西汀干预后HConEpiC中IL-1蛋白表达明显增多；氟西汀组TNF-α的IOD值247 926.8±20 334.1较对照组138 047.7±21 493.54增高，P＜0.05，提示氟西汀干预后HConEpiC中TNF-α蛋白表达明显增多。

图 3(Figure 3)

图 3 免疫荧光检测ERK在细胞中的定位 A，B，C分别为对照组ERK、DAPI及merge的图片；D，E，F分别为氟西汀组(5 μmol/L)ERK、DAPI及merge的图片，ERK显示为红色，DAPI核染色为蓝色

图 4(Figure 4)

图 4 免疫荧光检测P-ERK在细胞中的定位 A，B，C分别为对照组P-ERK、DAPI及merge的图片；D，E，F分别为氟西汀组(5 μmol/L)P-ERK、DAPI及merge的图片，P-ERK显示为红色，DAPI核染色为蓝色

图 5(Figure 5)

图 5 免疫荧光检测IL-1在细胞中的定位 A，B，C分别为对照组IL-1、DAPI及merge的图片；D，E，F分别为氟西汀组(5 μmol/L)IL-1、DAPI及merge的图片，IL-1显示为红色，DAPI核染色为蓝色

图 6(Figure 6)

图 6 免疫荧光检测TNF-α在细胞中的定位 A，B，C分别为对照组TNF-α、DAPI及merge的图片；D，E，F分别为氟西汀组(5 μmol/L)TNF-α、DAPI及merge的图片，TNF-α显示为红色，DAPI核染色为蓝色

对照组与氟西汀组(5 μmol/L)的细胞培养24 h后，分别提取细胞总蛋白，并用Western Blot实验检测各组ERK1/2、P-ERK1/2、IL-1、TNF-α蛋白的表达水平，BandScan软件分析胶片灰度值，用Excel对数据进行统计学处理。结果显示，三组独立实验结果相似，氟西汀组与对照相比，ERK1/2蛋白量表达无明显差异(P＞0.05)；氟西汀组P-ERK1/2、IL-1、TNF-α蛋白表达水平较对照组升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。ERK1/2、P-ERK1/2、IL-1、TNF-α蛋白Western Blot表达见图 7。

图 7(Figure 7)

图 7 ERK1/2、P-ERK1/2、IL-1、TNF-α蛋白Western Blot表达

丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)是一组在真核生物中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞内重要的信号传递者。MAPK参与许多生理及病理过程的调节，如细胞增殖、分化和凋亡、应激反应和炎性反应等。MAPK途径可以被不同的因子和环境因素激活，包括激素(例如:胰岛素)、生长因子(例如:血小板衍生物)、炎性细胞因子、肿瘤坏死因子等，是细胞外各种信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要通路。MAPK家族的3种主要蛋白包括:细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(C-jun NH₂-terminal kinase，JNK)和p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38)^[12]。丝裂原活化蛋白激酶-细胞外调节蛋白激酶(MAPK-ERK)通路具有信号放大功能，是近年来研究最为广泛的MAPK通路。

氟西汀是最常见抗抑郁药物，为5-羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)，主要通过选择性抑制神经元突触前膜5-HT泵对5-HT的再摄取，从而增加突触间隙5-HT的浓度，增强5-HT系统功能，起到抗抑郁作用。美国马里兰精神卫生中心Dwivedi等发现抑郁自杀患者中脑组织中的MAPK家族ERK1/2活性显著降低；5-HT受体可以激活MAPK，使其磷酸化，而抗抑郁药物可能通过介导参与MAPK-ERK参与抗抑郁作用。另外，长期抗抑郁治疗可能会引起急性和慢性炎症细胞因子增加，包括IL-1β、TNF-α、MMP-9等，这些细胞因子引起的眼部表面炎症, 可显著增加干眼症^[13]。

本研究中以不同浓度的盐酸氟西汀作用培养的人结膜上皮细胞发现，随着氟西汀浓度增加细胞增殖率呈缓慢降低状态，以氟西汀浓度为5 μmol/L进一步探讨其对蛋白量表达的影响。结果显示氟西汀组ERK的蛋白量表达与对照组相比差异无统计学意义，而P-ERK、IL-1β、TNF-α的蛋白量表达与对照组相比均增加。提示一定浓度的氟西汀可以激活MAPK-ERK通路，导致ERK大量磷酸化，而激活的MAPK-ERK通路可导致炎性细胞因子表达增加，炎性细胞因子亦可进一步激活MAPK途径，形成正反馈通路，人结膜上皮细胞内多种炎性因子的堆积导致干眼症发生。本研究为抗抑郁药引起的干眼问题提供了相关的实验室依据，并希望为干眼症的治疗提供新的思路。