武汉大学学报(医学版)   2017, Vol. 38Issue (5): 719-723   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.05.007.
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引用本文 

汪婷, 程真顺, 刘媛, 邹靖峰. TGF-β1/Smad2通路参与IL-17诱导的A549细胞上皮-间质转化[J]. 武汉大学学报(医学版), 2017, 38(5): 719-723. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.05.007.
WANG Ting, CHENG Zhenshun, LIU Yuan, ZOU Jingfeng. TGF-Beta1/Smad2 Pathway Is Involved in the Epithelial-Mesenchymal Transition Induced by Interleukin-17 in A549 Cells[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2017, 38(5): 719-723. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.05.007.

作者简介

汪婷，女，1990-，医学硕士生，主要从事肺纤维化发病机制研究

基金项目

湖北省自然科学基金资助项目(编号：2014CFB299)

通讯作者

程真顺，男，1971-，医学博士，主任医师，硕士生导师，主要从事呼吸重症和肺纤维化发病机制研究

文章历史

收稿日期：2017-01-25
Contents              Abstract             Full text              Figures/Tables              PDF
TGF-β1/Smad2通路参与IL-17诱导的A549细胞上皮-间质转化
汪婷 , 程真顺 , 刘媛 , 邹靖峰     
武汉大学中南医院呼吸内科 湖北 武汉 430071
收稿日期：2017-01-25
基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(编号：2014CFB299)
作者简介：汪婷，女，1990-，医学硕士生，主要从事肺纤维化发病机制研究
通讯作者：程真顺，男，1971-，医学博士，主任医师，硕士生导师，主要从事呼吸重症和肺纤维化发病机制研究
[摘要] 目的: 探讨白细胞介素(IL)-17对A549细胞上皮-间质转化的影响及TGF-β1/Smad2信号通路在其中的作用。方法: 用不同浓度(0, 10, 25, 50, 100 ng/ml)IL-17刺激A549细胞48 h，RT-PCR检测E-钙黏蛋白(E-cad)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)、TGF-β1的表达。将体外培养的细胞分为3组：对照组、IL-17(100 ng/ml)组、IL-17+SB431542组。48 h后收集各组细胞，RT-PCR和Western Blot检测E-cad、α-SMA、TGF-β1、Smad2、和p-Smad2的表达。结果: 不同浓度的IL-17作用后，E-cad在50 ng/ml IL-17组时表达下调，与浓度呈负相关；α-SMA在100 ng/ml IL-17组时表达上调；TGF-β1在25 ng/ml IL-17组时表达上调，与浓度呈正相关。与对照组相比，IL-17组E-cad表达下调，α-SMA、TGF-β1、p-Smad2表达均增加，Smad2蛋白表达水平无明显变化；与IL-17组比较，IL-17+SB431542组Smad2蛋白表达水平无明显变化，TGF-β1、p-Smad2、α-SMA蛋白表达均降低，E-cad的表达明显增加。结论: TGF-β1/Smad2通路参与IL-17诱导的A549细胞上皮-间质转化。
关键词：上皮-间质转化    白细胞介素-17    转化生长因子β1    Smad信号通路    
TGF-Beta1/Smad2 Pathway Is Involved in the Epithelial-Mesenchymal Transition Induced by Interleukin-17 in A549 Cells
WANG Ting, CHENG Zhenshun, LIU Yuan, ZOU Jingfeng     
Dept. of Respiratory Medicine, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China
[Abstract] Objective: To investigate the effect of interleukin 17 (IL-17) on epithelial-mesenchymal transition of A549 cells and the role of TGF-β1/Smad2 signaling pathway in the process. Methods: Human alveolar epithelial (A549) cells were cultured in vitro and stimulated with different concentrations (0, 10, 25, 50, 100 ng/ml) of IL-17 for 48 h, the expression of E-cadherin (E-cad, an epithelial marker), α-smooth muscle actin (α-SMA, a mesenchymal marker) and TGF-β1 were detected by RT-PCR. Then, A549 cells were randomly divided into three groups: control group, IL-17 group (treated by IL-17 with 100 ng/ml) and IL-17+ SB431542 group. After given the corresponding processing, cells were collected after 48 hours and the expressions of E-cad, α-SMA, TGF-β1, p-Smad2 and Smad2 were evaluated by quantitative RT-PCR and Western Blot. Results: The expression of E-cad was down-regulated from 50 ng/ml IL-17 treatment, which negatively correlated with concentrations. α-SMA was up-regulated in 100 ng/ml of IL-17 group and TGF-β1 was also up-regulated from 25 ng/ml of IL-17 with a positive correlation with concentrations. Compared with the control group, the expression of E-cad was significantly decreased, α-SMA, TGF-β1 and p-Smad2 expressions were obviously increased after IL-17 exposure, while the expression of Smad2 did not show significant difference. Compared with the IL-17 group, the expression levels of TGF-β1, p-Smad2 and α-SMA were markedly decreased and E-cad was significantly increased after a selective inhibitor of TβRI kinases-SB431542 was added, whereas the expression of Smad2 was not significantly different. Conclusion: TGF-β1/Smad2 signaling pathway may be involved in the epithelial-mesenchymal transition induced by interleukin-17 in A549 cells.
Key words: Epithelial-Mesenchymal Transition    Interleukin-17    Transforming Growth Factor -β1    Smad Signaling Pathway    

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是最常见的弥漫性肺纤维化疾病[1]，是一种持续性进展、不可逆的并且致命的慢性肺部疾病。至今病因未明，中位生存期仅2.5-3.5年，目前缺乏有效的治疗手段及治疗药物[2]。据流行病学资料统计，近年来其发病率有上升趋势[3]。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是IPF重要的发病机制，肺泡上皮细胞受到各种致病因素的刺激，获得间质细胞的表型，是成纤维细胞及肌成纤维细胞的重要来源[4]。白细胞介素(interleukin, IL)-17是一种具有多效性的细胞因子，与心[5]、肝[6]、肾[7]、肠[8]等器官及组织的纤维化相关，最近研究表明IL-17与肺纤维化的发病机制有关[9]，具有促进肺成纤维细胞增殖、转化及诱导EMT发生的作用，其作用机制是通过转化生长因子(trforming growth factor, TGF)-β1来调节EMT[9, 10]。TGF-β1在肺纤维化中起重要作用[11]，是EMT中的关键因子。Smad2信号通路是TGF-β1作用的经典通路之一，在细胞内TGF-β1与其受体形成复合物，进而作用于Smad2，使TGF-β1发挥重要的生物学效应作用[12]。因此我们推测IL-17可能通过TGF-β1/Smad2信号通路调节EMT，进而导致肺纤维化。

本研究通过体外培养人肺泡上皮细胞来源的A549细胞，给予IL-17刺激，证实IL-17致EMT的作用，并探讨其信号转导通路，为进一步研究IPF的分子生物学机制及寻找抗纤维化治疗新靶点提供实验基础。

1 材料与方法 1.1 主要实验材料和试剂

A549细胞株购自中国科学院上海细胞库；RMPI-1640培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自浙江四季青公司；0.25%胰酶、PBS均购自杭州吉诺公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Thermo公司；单克隆兔抗人E-钙黏蛋白(E-cadherin, E-cad)，E-cad抗体、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体、TGF-β1抗体均购自英国Abcam公司；单克隆兔抗人p-Smad2、Smad2抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；HRP标记羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；重组人IL-17购自美国Peprotech公司；TGF-β1受体抑制剂SB431542购自美国Selleckchem公司；EASYspin组织/细胞RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱公司；逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ均购自日本TaKaRa公司。

1.2 细胞的培养及分组

A549细胞于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 mg/L链霉素的RMPI-1640完全培养基中，37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下常规培养，隔天换液，至细胞融合度达到75%-80%时，用0.25%胰酶消化传代。

将传代的A549细胞接种于6孔板中，分为5组，待细胞融合度达到70%后分别加入终浓度为0, 10, 25, 50, 100 ng/ml IL-17处理，作用48 h，观察不同浓度IL-17诱导的E-cad、α-SMA和TGF-β1的mRNA表达的影响。

将传代的A549细胞分为：对照组(RMPI-1640培养液)、IL-17组(RMPI-1640培养液中加入100 ng/ml IL-17)、IL-17+SB431542组(RMPI-1640培养液中加入10 μmo/L SB431542处理1 h后，加入100 ng/ml IL-17)。作用48 h后观察IL-17组及IL-17+SB431542组对E-cad和α-SMA的mRNA和蛋白表达的影响，IL-17组及IL-17+SB431542组对TGF-β1、p-Smad2、Smad2蛋白表达的变化。

1.3 RT-PCR法检测E-cad、α-SMA和TGF-β1的mRNA表达

收集处理好的细胞，按照RNA试剂盒说明书提取总RNA，紫外分光光度法检测含量和纯度，1.5%琼脂糖电泳检测RNA完整性。根据TaKaRa逆转录试剂盒采用两步法将样品逆转录成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (TaKaRa)试剂盒说明书操作，特异性引物序列见表 1，由天一辉远生物工程(北京)股份有限公司合成。在PCR仪(Bio-Rad)上进行实时定量PCR反应，反应条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。采用2-ΔΔct法，以GAPDH为参照，定量E-cad、α-SMA和TGF-β1的mRNA变化。

表 1 引物的序列
1.4 Western Blot检测E-cad、α-SMA、TGF-β1蛋白表达及Smad2磷酸化水平

收集处理后的细胞，加入细胞裂解液于冰上裂解细胞并提取总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质。将凝胶上的蛋白转到PVDF膜，5%脱脂奶粉室温下封闭2 h。采用单克隆兔抗人E-cad、α-SMA、TGF-β1等4 ℃孵育过夜。TBST溶液漂洗3次，每次10 min。分别加入HRP标记羊抗兔二抗常温孵育2 h。TBST溶液漂洗如前，ECL显影，应用AlphaEaseFC成像分析系统分析各条带并记录光密度强度，分析实验结果。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0统计分析软件分析数据，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较用t检验，检验结果以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 不同浓度IL-17对A549细胞E-cad、α-SMA、TGF-β1的mRNA的影响

与对照组比较，E-cad的表达在IL-17浓度为50 ng/ml时开始下调(P＜0.01)，处理组随着IL-17浓度的增加E-cad表达下调，与浓度呈负相关；而α-SMA的表达在IL-17浓度为100 ng/ml时表达上调(P＜0.01)；同时TGF-β1的表达在IL-17浓度为25 ng/ml时开始上升(P＜0.05)，随着IL-17浓度的增加TGF-β1表达上调，与浓度呈正相关，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。结果表明，IL-17能调节EMT相关mRNA的变化，并且浓度为100 ng/ml时EMT变化最明显，故后续试验IL-17选用100 ng/ml作为工作浓度；随着IL-17浓度的增加，TGF-β1的表达上调，提示IL-17诱导EMT可能与TGF-β1的表达上调有关。

图 1 不同浓度IL-17对A549细胞E-cad、α-SMA、TGF-β1的mRNA的影响 与对照组比较, *P＜0.05，与对照组比较, **P＜0.01
2.2 IL-17对A549细胞E-cad、α-SMA蛋白的影响

用100 ng/ml IL-17作用A549细胞48 h后，检测E-cad、α-SMA蛋白表达。与对照组相比，IL-17组E-cad表达下调，α-SMA表达上调。结果表明，IL-17能调节EMT相关蛋白的变化，能诱导EMT发生(图 2)。

图 2 IL-17对A549细胞E-cad、α-SMA蛋白的影响 Control:对照组；IL-17：IL-17诱导干预组
2.3 Western Blot检测TGF-β1、Smad2、p-Smad2蛋白的表达

与对照组比较，IL-17组TGF-β1、p-Smad2表达增加，Smad2表达无明显变化；结果表明IL-17能激活A549细胞中的TGF-β1/Smad2信号通路；为进一步论证TGF-β1/Smad2信号通路在其中的作用，加入TGF-β1受体抑制剂(SB431542) 后，与IL-17组相比，TGF-β1、p-Smad2表达下调，Smad2表达无明显变化，证实SB431542能抑制TGF-β1/Smad2信号通路，见图 3。

图 3 IL-17对A549细胞TGF-β1/Smad2信号通路蛋白的影响 Control:对照组；IL-17：IL-17诱导干预组；IL-17+SB431542: IL-17+TGF-β1受体抑制剂组(SB431542)
2.4 抑制TGF-β1/Smad2信号通路对IL-17诱导A549细胞E-cad和α-SMA的mRNA和蛋白的影响

为进一步研究TGF-β1/Smad2信号通路对IL-17诱导A549细胞的作用，我们用TGF-β1受体抑制剂(SB431542) 将TGF-β1/Smad2信号通路抑制后，观察IL-17诱导A549细胞EMT相关mRNA和蛋白表达的影响。结果显示，与IL-17组比较，加入抑制剂后E-cad的mRNA和蛋白表达均增加，α-SMA的mRNA和蛋白表达均下降(P＜0.01)，表明SB431542能部分抑制IL-17诱导A549细胞EMT相关的表达，说明IL-17可以通过激活TGF-β1/Smad2信号通路诱导A549细胞发生EMT，见图 4。

图 4 抑制TGF-β1/Smad2信号通路后，观察IL-17对EMT相关mRNA和蛋白的影响 与其他组比较, **P＜0.01
3 讨论

IPF的发病机制非常复杂，至今尚未完全明确[13, 14]，成纤维细胞在IPF病因中发挥重要作用，EMT是肺成纤维细胞重要的来源之一[15, 16]，并且在IPF的发病机制研究中，EMT也越来越受到重视[17]。

研究表明IL-17参与调控EMT相关基因的表达[18]。IL-17细胞因子家族包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F 6个成员, 其中IL-17A是该家族的标志性细胞因子，简称IL-17。IL-17是一种具有多效性的细胞因子，可以作用于多种细胞增强炎性分子的表达，并且与多种器官的纤维化相关。IL-17通过促进心肌成纤维细胞增殖和迁移而加速心肌纤维化的发展[5]；同时可以通过诱导炎性细胞因子和TGF-β1的表达促进肝纤维化[6]。有研究发现在IPF患者的支气管肺泡灌洗液体中，IL-17有所增加，表明IL-17与肺纤维化的发病机制有关[19]。博来霉素诱导IL-17产生高度依赖于TGF-β1的信号。重组IL-17诱导的纤维化依赖于TGF-β1途径，证实了IL-17和TGF-β1在肺纤维化的发展中是相互依赖的[20]。Mi等[9]研究发现IL-17促进成纤维细胞大量合成细胞外基质，阻断IL-17可以显著降低肺纤维化的严重程度，其机制是通过TGF-β1依赖的信号通路而减轻EMT过程。因此，我们推测IL-17可能通过上调TGF-β1的表达诱导EMT。

培养肺泡Ⅱ型上皮细胞是研究其特性的重要手段，由于它培养后表型丧失快，基本不传代，并且培养难度较大，不易获得较高纯度、理想的肺泡Ⅱ型上皮细胞，而A549细胞具有肺泡Ⅱ型上皮细胞的重要特性，因此本研究使用A549细胞系代替肺泡Ⅱ型上皮细胞。预实验中，为摸索IL-17诱导A549细胞发生EMT的最适浓度，我们设置了0，10，25，50，100 ng/ml 5个组，用RT-PCR检测，结果显示IL-17浓度为50 ng/ml时，E-cad表达开始下调，浓度为100 ng/ml时α-SMA表达上调，通过Western Blot检测也证实了浓度为100 ng/ml时IL-17可以有效的诱导A549细胞发生EMT，与Gu等[21]研究一致。因此本实验采用100 ng/ml IL-17建模。实验还发现IL-17上调TGF-β1的表达，且TGF-β1的表达与IL-17浓度正相关，表明IL-17可能通过上调TGF-β1的表达诱导EMT，与Meng等[6]得出的结论一致。此外我们发现IL-17能激活Smad2磷酸化，为进一步论证TGF-β1/Smad2信号通路在IL-17诱导EMT中的作用，我们通过TGF-β1特异性受体抑制剂SB431542抑制TGF-β1/Smad2通路，发现抑制该通路能抑制IL-17对EMT相关mRNA和蛋白的表达。

本研究明确了IL-17能诱导A549细胞发生EMT的作用。同时证明了TGF-β1/Smad2信号通路在该过程中发挥了重要作用，我们可以考虑以此作为抑制IPF的新靶点。本实验中使用了通路抑制剂来证明研究假设，提示通路抑制剂具有减弱A549细胞发生EMT的作用，对于IPF的特异性治疗药物的开发和研究具有重要的意义。

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