青光眼是一种多因素引起的以视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)变性为特征的全球范围的致盲性眼病^[1]。视觉的建立包括丘脑、眼球以及视路，而在两个器官之间传递视觉信号的唯一的媒介就是视网膜神经节细胞^{[2, 3]}。不仅如此，RGC还能在胞质和胞体之间运输营养物质^[4]。因而，一旦RGC轴突损伤并且细胞逐渐丢失，将导致进行性视力丧失和视野缺损的青光眼性视神经病变^{[5, 6]}。

青光眼的危险因素包括年龄、家族遗传史、高眼压以及近视^{[7, 8]}，其中，普遍认为高眼压是导致视力丧失的主要因素^{[8, 9]}。所以，现今对于青光眼的治疗的主要目的就是控制眼压，无论是通过眼药水或者是采用手术，都是为了将眼压降低到正常数值甚至低于正常值。但这些治疗措施都无法阻止RGC的死亡^[10]。并且，眼药水有一定的局限性，比如由于频繁点眼就需要良好的依从性，或术后流出通道再次受阻所致生物利用度低^[11]。鉴于以上种种原因，基因治疗在各种领域中兴起。

现已有研究证实神经生长因子(nerve growth factors，NGFs)对受损RGC有保护作用，比如脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)和睫状上皮营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)^{[12, 13]}。然而，这些多肽类物质的半衰期很短，无法长期存在^[14]。因此，重组病毒载体作为一种媒介，能使NGFs在体内外的研究中维持较长时间^[15-17]。一方面，近来有研究表明CNTF对基因表达、细胞增殖和促进轴突的再生^{[18, 19]}。另一方面，即使在病理条件下CNTF也能发挥生物性效应^[20-22]。

如今关于青光眼中RGC死亡机制一致认为有缺少轴突运输的神经营养因子，活性氧增多，兴奋性神经毒性和长期间断性缺血^{[23, 24]}。而其中活性氧增多和长期缺血的相互影响导致RGC死亡的恶性循环^{[23, 25]}。另外，活性氧不但能直接导致RGC的死亡，同样能作为第二信使激活其他信号通路间接引起RGC的死亡^{[26, 27]}。根据以上理论基础，本文采用过氧化氢损伤RGC-5造模，并研究CNTF对该模型的作用。

RGC-5在含有胎牛血清、青霉素及链霉素的DMEM培养基中，在37 ℃，5% CO₂条件下培养，每2 d更换一次培养基。选用生长对数期的细胞进行Brn-3a鉴定。弃去培养基，加封闭液(BSAT)覆盖，4 ℃过夜。倒去封闭液，加一抗Brn-3a(1：100)，4 ℃过夜。洗净后加入二抗Cy3(1：300)，室温放置2 h。

采用RT-PCR扩增CNTF基因，引物为上游：5′-GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC GCC ACC ATG GCT TTC ACA GAG CAT TC-3′；下游：5′-TCC TTG TAG TCC ATA CCC ATT TTC TTG TTG TTA GC-3′，并用琼脂糖凝胶电泳鉴定后，纯化的CNTF基因与线性化载体pGC-FU构建重组慢病毒载体。将重组载体转化到大肠杆菌感受态细胞中培养，长出的克隆进行后续PCR鉴定。pGC-FU-CNTF阳性克隆鉴定成功后，转染处于对数生长期的293T细胞，再Western Blotting检测目的基因表达并测定病毒滴度。将合适滴度的重组慢病毒载体转染对数期的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)。通过观察慢病毒携带的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)判断转染是否成功。

实验分组为选用生长对数期的细胞在培养基中分别加入50, 75, 100, 125, 150 μmol/L过氧化氢，对照组不加过氧化氢。各组分别培养0.5, 1, 1.5和2 h后，MTT法检测细胞的存活率。根据结果选择最恰当的药物浓度和作用时间。

RGC-5与转染重组病毒载体的骨髓间充质干细胞共培养后3 d和7 d后，用RT-PCR测定细胞内CNTF、神经胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)和BDNF的RNA表达量，再与未转染重组病毒载体的对照组相互比较，以GAPDH为内参。TRIzol法提取总RNA后，设计引物，合成cDNA。引物如下：CNTF：上游：5′-CCA CCT ACA TCC CCA ATA CC-3′；下游：′-GCT GAC ACT TAT GGA GAC CTT G-3′；BDNF：上游：5′-GGT TAT TTC ATA CTT CGG TTG C-3′；下游：5′-CCC ATT CAC GCT CTC CAG-3′；GDNF：上游：5′-CGA TAT TGT AGC GGT TCC TGT-3′；下游：5′-CCT TGT CAC TTG TTA GCC TTC T-3′；GAPDH：上游：5′-TTC AAC GGC ACA GTC AAG G-3′；下游：5′-CTC AGC ACC AGC ATC ACC-3′。PCR总反应体系为25 μl。用2^(-ΔΔCt)法进行定量计算。

建模成功后，用两种不同的给药方式干预损伤模型。实验分组为：pGC-FU-CNTF组，对照组为无干预的过氧化氢模型。重组病毒组的干预7 d后予以过氧化氢损伤。MTT法检测各组细胞存活率。

所有数值采用x±s记录，组别之间采用单因素ANOVA分析是否存在统计学差异，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

RGC-5细胞呈贴壁生长，细胞形态为梭形或多角形，可见突起，经Brn-3a荧光染色后，显微镜下可见细胞胞质和轴突发出均匀红色荧光(图 1)。

图 1(Figure 1)

图 1 RGC-5培养后免疫荧光鉴定结果 Brn-3a染色后可见细胞呈梭形，胞质和轴突发红色荧光

在同一时间点，H₂O₂浓度越高，OD值逐渐减低，RGC-5抑制率逐渐增高，存活率下降。在同一浓度，随时间点的增加，OD值逐渐减低，RGC-5抑制率逐渐增高，存活率也逐渐降低。H₂O₂浓度从50 μmol/L升高到125 μmol/L时，抑制率逐渐增高，达到凋亡高峰，125 μmol/L H₂O₂是建立RGC-5氧化应激损伤的最适浓度，≥150 μmol/L会明显增加RGC凋亡，诱导细胞发生明显损伤，此时再增加H₂O₂的浓度对细胞损伤的变化无显著增加(表 1)。虽然在过氧化氢浓度为150 μmol/L时，细胞仍有一定的存活率，但细胞变性程度重，考虑到后续实验，最终，以125 μmol/L H₂O₂作用2 h建立RGC-5损伤模型，此时细胞死亡率为23.23%。

表 1(Table 1)

表 1 不同浓度H2O2在作用0.5, 1, 1.5, 2 h后RGC-5抑制率(x±s, %) 浓度(μmol/L) 0.5 h 1 h 1.5 h 2 h 50 19.34±9.74 20.22±8.59 24.97±6.05 16.62±6.63 75 17.38±8.77 23.79±1.84 20.88±6.16 20.65±7.70 100 19.69±5.52 25.29±6.68 18.92±4.92 22.81±2.74 125 18.25±10.21 30.24±3.01 26.08±7.03 23.23±0.43 150 65.10±2.80 67.87±3.26 65.73±4.42 67.82±4.20 RGC-5细胞存活率与H2O2作用的时间和浓度呈负相关，并且当H2O2浓度大于150 μmol/L时，细胞存活率明显降低

表 1 不同浓度H2O2在作用0.5, 1, 1.5, 2 h后RGC-5抑制率(x±s, %)

荧光显微镜下可见发绿色荧光的BMSC，表明连接GFP的pGC-FU-CNTF被转染到BMSC(图 2)。另一方面，通过RT-PCR证实相对未转染重组慢病毒的对照组，pGC-FU-CNTF组CNTF mRNA丰度值明显增高，并且共培养7 d后CNTF mRNA丰度值(817.35 ±177.40)高于3 d(8.30±2.64, P＜0.05)及对照组(1.01±0.18, P＜0.05)(表 2)。

图 2(Figure 2)

图 2 CNTF重组慢病毒转染BMSC 重组慢病毒转染BMSC后，病毒载体自带GFP(绿色)标记的BMSC表明转染成功

表 2(Table 2)

表 2 CNTF、BDNF、GDNF在转染后共培养3 d、7 d的mRNA含量 组别 CNTF BDNF GDNF 对照组 1.01±0.18 1.00±0.10 1.00±0.09 共培养3 d组 8.30±2.64# 0.77±0.16# 0.55±0.09* 共培养7 d组 817.35±177.40* 313.61±168.39* 0.74±0.21# 与对照组比较，*P＜0.05，#P＞0.05

表 2 CNTF、BDNF、GDNF在转染后共培养3 d、7 d的mRNA含量

由于BMSCs能分泌多种生长因子，因而我们还检测了GDNF、BDNF的mRNA含量。与对照组(1.00±0.10)相比，实验组培养7 d后BDNF的mRNA含量有所增加(313.61±168.39, P＜0.05)，但与对照组相比(1.00±0.09)GDNF的mRNA含量在实验组培养3 d(0.55±0.09，P＜0.05)后降低(表 2)。

pGC-FU-CNTF组不仅能持续给药，而且转染的BMSC能分泌神经生长因子，对该损伤模型均有保护作用，使RGC-5细胞死亡率从31.93%降至19.23%。

RGC作为唯一能传递视觉信号的细胞，在青光眼疾病进展中不断丧失，最终造成不可逆的视力丧失，遗憾的是至今没有缓解的办法。在一些研究中证实神经生长因子对受损的RGC有保护作用，同样，本研究表明CNTF对过氧化氢损伤RGC模型有保护作用。现今研究揭示RGC死亡机制如下：①轴浆运输反向导致神经营养因子缺乏; ②谷氨酸兴奋性中毒; ③自由基产生; ④一氧化氮中毒; ⑤细胞凋亡^[28]。我们采用过氧化氢作用于RGC-5，通过氧化应激损伤RGC-5，造成细胞不可逆的死亡。建模的过程中，过氧化氢作为致损因素，过氧化氢的浓度与RGC-5的存活率负相关。就如同在许多疾病进程中，往往许多致病因素难以发现，即使得知发病原因，该因素也未必能去除，在致病微环境中，予以保护作用的各类物质反而是一种相对而言更可行的方法。RGCs作为一种永久细胞，不可再生，数量的多少直接关系到视功能的好坏，如何能最大程度发挥CNTF的保护作用是值得探究的。

在建立H₂O₂损伤模型时，过氧化氢浓度50-125 μmol/L之间，对RGC-5的损伤凋亡的影响是逐渐增加的，但当过氧化氢浓度增加到150 μmol/L时，所致RGC-5损伤大幅度明显增加，这可能是表明H₂O₂对细胞损伤开始是线性相关，但是过氧化氢的浓度升高到一定程度时，过多的氧自由基会恶化细胞的存活环境，虽然MTT检测细胞活性时仍有一定的存活率，但是很有可能所有存活细胞都处于变性阶段，而此时增加过氧化氢的浓度会逐渐加重各个细胞的变性程度，直至细胞形成不可逆损伤。这也可以推测在视神经损伤、青光眼或糖尿病视网膜病变发生时，早期采取措施，对阻止病变的恶化、视力的丧失有决定性的作用，而晚期即使采用同样的治疗方式，效果也大不如前。只是早期诊断、早期预防实属不易，可以借助图形视网膜电流图(pattern electroretinogram，PERG)、视觉诱发电位(visual evoked potential，VEP)等判断RGC的受损^[29]。我们选择125 μmol/L H₂O₂，作用2 h造模，首先是因为此时RGC-5处于凋亡高峰，但同时为了保证细胞的活性及功能，在后续的实验过程中，与CNTF慢病毒转染骨髓间充质干细胞共培养时，考虑细胞微环境的改变可能会对RGC-5的生存状况会形成影响，所以保留RGC-5的较高存活率。

我们没有直接将含CNTF的慢病毒转染RGC-5，而是选择骨髓间充质干细胞，一方面是因为CNTF通过异源三聚体受体复合物(CNTFRα, gp130和LIFRβ)作用于神经细胞^[30]。CNTF的受体CNTFRα, 是依靠糖基-磷脂酰肌醇连接在细胞膜上，而CNTF要先和磷酸化的CNTFRα结合后才能与胞内的gp130和LIFRβ结合发挥作用^{[31, 32]}, 因而若是直接转染RGC-5，由于RGC-5不具备分泌蛋白的能力，CNTF很有可能在胞内堆积，不能发挥作用。另外，RGC-5作为一种神经细胞，相较于间充质干细胞更为脆弱，且没有间充质干细胞生长旺盛并合成大量的神经营养因子。间充质干细胞本身分泌多种具有神经营养和/或神经保护效应的细胞因子，包括CNTF，可促进宿主细胞存活及神经再生。

总的来说，CNTF是一种对RGCs有神经保护作用的神经营养因子，可以通过不同的方式作用于受体细胞发挥作用，但若是在体内该以何种信号通路发挥重要作用则有待研究。