骨肉瘤是青少年和儿童期常见的原发恶性骨肿瘤，侵袭转移能力强，最常见的转移部位为肺，致死率高^[1]。尽管新辅助化疗使骨肉瘤患者的5年生存率提高到60%-70%，但是，随着化疗的耐药和毒副作用等问题出现，骨肉瘤传统治疗方法已进入平台期^[2]。研究表明，骨肉瘤患者一旦出现复发或者转移，其远期生存率将小于20%^[3]。miRNA(miR)在骨肉瘤发生发展中的机制研究已经成为热点之一，有报道显示，miR-99a在肝癌^[4]、乳腺癌^[5]、卵巢癌^[6]和膀胱癌^[7]等癌细胞中均低表达，上调miR-99a水平，这些肿瘤细胞的生物学特性被不同程度的抑制。

本课题组前期研究已发现，miR-99a在骨肉瘤细胞中表达量比正常成骨细胞高16倍^[[8]，本研究拟进一步检测miR-99a在肿瘤组织及正常组织中的表达差异，观察下调miR-99a水平对骨肉瘤的生物行为学特点的影响，以期能为诊断骨肉瘤和发现肿瘤转移提供新的理论依据。

人骨肉瘤143B、MG-63和U2OS细胞株, 由本实验室提供；has-miR-99a-inhibitor和miRNA阴性对照物(negative control)购自广州锐博生物科技有限公司(Ribobio)，Lipofectamine 2000^TM(Invitrogen公司)；DEPC水，75%乙醇，异丙醇，氯仿，DMEM培养基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，PBS缓冲液，二甲基亚砜，移液器，去RNA酶EP管，离心管，培养板，BD transwell小室，Matrigel基质胶，Opti-MEMI无血清培养基、CCK8试剂盒，AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒等均由华联科生物有限公司提供；细胞培养箱，倒置显微镜，超速离心机，酶标仪器，水浴锅和流式细胞仪等均由武汉大学中南医院科研中心提供。

将人骨肉瘤细胞系143B、MG-63、U2OS、肝癌细胞系hepG2、结肠癌细胞系lovo用含10%FBS的DMEM培养基，hFOB1.19采用含10%FBS DMEM-F12(Hams)培养基，乳腺癌细胞系MCF-7和肺癌细胞系A549采用含10%FBS的RPMI 1640培养基，在37 ℃、5%CO₂的细胞培养箱内培养。调整143B细胞为合适浓度，向孔板中加入细胞悬液，置于培养箱中培养，待贴壁细胞达到70%-90%时进行瞬时转染实验。实验分组：实验组(骨肉瘤143B细胞转染miR-99a inhibitor)、阴性对照组(转染inhibitor NC)和空白对照组(加入PBS作为对照)，miR-99a inhibitor转染浓度为150 nmol/L。

143B细胞在转染48 h后，按照Trizol一步法提取各组细胞总RNA量，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和浓度。引物序列为：miR-99a(F):5′-AACCCGTAGATCCGATCTTGTG-3′, miR-99a(R):3′-TGGTGTCGTGGAGTC G-3′ ^[5]。以U6作为内参，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录，取逆转录产物进行PCR扩增，每个样本均进行miR-99a和U6的RT-PCR反应，计算各样本的miR-99a表达量。

实验分组：实验组(转染miR-99a inhibitor)、阴性对照组(转染inhibitor NC)，空白对照组，并设置只含培养基而无细胞的调零组，miR-99a inhibitor转染浓度为150 nmol/L，调整细胞浓度为1×10⁴/L，在96孔板每孔加入100 μl细胞悬液，置于37 ℃，5% CO₂培养箱预培养，转染miR-99a inhibitor及阴性对照物，待转染1, 2, 3, 4 d后分别检测增殖，向每孔中加入10 μl CCK8溶液，注意不要生成气泡，将培养板置于培养箱内继续孵育1-4 h，用酶标仪测定各孔450 nm处吸光度值(OD值)。

将各组转染48 h后细胞用不含EDTA的胰酶消化，用PBS重悬，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，用PBS洗涤、离心2遍，弃上清，加缓冲液重悬细胞，然后依次加入加入10 μl Annexin V-FITC和10 μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，室温避光孵育20 min，置于冰水浴中，随即流式细胞仪检测。

用记号笔在6孔板背后划横线，每0.5-1.0 cm一道，共5条，按上述方法进行铺板、转染，转染24 h后用枪头比着直尺，垂直于背后横线划痕，用PBS洗涤3次，保证划痕下无细胞，加入无血清培养基，置于培养箱继续培养，按0, 12 h取出拍照。

将基质胶用Opti-MEMI无血清培养基按1:8稀释，试验前1 d铺胶。细胞转染48 h后，用无血清培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁵个/ml，取200 μl加入Transwell小室上室中，在下室中加入600 μl完全培养基。在37 ℃，5%CO₂的培养箱中孵育12 h，取出小室，用棉签抹去上层细胞，用95%乙醇固定15 min，结晶紫染色10 min，在显微镜下观察，随机取6个视野，统计各组穿过基质膜的细胞个数。

① 制备蛋白样品：弃掉培养基，并用预冷的PBS洗涤，胰蛋白酶消化收集细胞，4 ℃，1 000 g离心5 min，用预冷PBS液重悬细胞，室温、1 000 r/min离心5 min，弃净PBS液后EP管置于冰上；在蛋白裂解液中加入PMSF，裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，弃掉上清液，-20 ℃保存。②测定蛋白样品浓度，采用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定样品蛋白的浓度；③样品蛋白含量检测：取96孔板，3孔为一组，作为复孔，在每孔中加入2 μl蛋白样品和18 μl的裂解液，用移液器吹打，充分混合均匀，加配制好的BCA工作液，酶标仪检测A₅₇₀值，取复孔读数值的平均，根据标准曲线计算真实蛋白浓度。④SDS-PAGE电泳；⑤转膜；⑥免疫反应；⑦化学发光、显影、定影；⑧凝胶图像分析。

采用SPSS 18.0软件处理和分析数据，计量资料以均数±标准差(x±s)形式表示，采用非参数检验分析qRT-PCR实验结果，χ²检验分析流式细胞数据，采用单因素方差分析多个样本均数，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。采用Graphpad Prism 5.0软件绘制图表。

为研究miR-99a在骨肉瘤中的作用，本课题首先探索miR-99a在骨肉瘤中的表达情况，本研究采用RT-PCR技术检测了miR-99a在骨肉瘤组织与瘤旁骨组织中的相对表达量，miR-99a在7例骨肉瘤组织中的相对表达量(0.81±0.06)要明显高于瘤旁骨组织(0.48±0.06) (P＜0.01, 见图 1)。

图 1(Figure 1)

图 1 miR-99a在骨肉瘤组织与瘤旁骨组织中的表达

3组骨肉瘤细胞系miR-99a表达量均高于人成骨细胞hFOB1.19，差异有显著统计学意义(P＜0.01，见图 2)，miR-99a在三组骨肉瘤细胞系表达差异无统计学意义。

图 2(Figure 2)

图 2 miR-99a在骨肉瘤细胞系中相对表达量高于成骨细胞系 4组细胞系miR-99a相对表达量分别为，hFOB1.19(0.26±0.01)、143B(1.01±0.02)、MG-63(0.91±0.03)和U2OS(0.80±0.01)；与hFOB1.19相比, *P＜0.05

本课题取miR-99a相对表达量最高的143B作为研究对象，再以其他非骨肉瘤肿瘤细胞系作为对照研究，检测结果显示骨肉瘤细胞系143B中miR-99a相对表达明显高于四种非骨肉瘤细胞系(P＜0.05，见图 3)。

图 3(Figure 3)

图 3 miR-99a在骨肉瘤细胞系中相对表达高于其他肿瘤细胞系 143B (1.00±0.01, n=3)、Lovo(0.21±0.03)、hepG2(0.55±0.03)、A549(0.10±0.01)和MCF-7(0.29±0.02);与143B细胞系组相比, *P＜0.05

骨肉瘤143B细胞转染miR-99a inhibitor 48 h后，RT-PCR结果显示，miR-99a inhibitor的瞬时转染效率83%。流式细胞术分析显示，与空白对照组、阴性对照组相比，miR-99a inhibitor转染组早期凋亡和晚期凋亡均未明显增加(P＞0.05)。

划痕试验结果表明，0, 24 h时间点细胞迁移能力对比显示，瞬时转染miR-99a inhibitor的143B细胞迁移能力明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05)，实验组的迁移抑制率为35.8%(图 4)。

图 4(Figure 4)

图 4 下调miR-99a后，划痕实验检测骨肉瘤143B细胞迁移能力

Transwell小室结果表明，miR-99a inhibitor转染组143B细胞穿过小室底膜的数目明显低于阴性对照组和空白对照组，这提示，下调miR-99a表达后，143B细胞的侵袭能力得到抑制。见图 5。

图 5(Figure 5)

图 5 3组143B细胞侵袭能力实验结果 A: miR-99a inhibitor转染组143B细胞穿过小室底膜的数目明显低于NC组和Blank组，*P＜0.05; B:×400

将miR-99a inhibitor(150 nnmol/L)瞬时转染至骨肉瘤143B细胞48 h后，Western Blotting检测蛋白RECK、MMP-2和MMP-9蛋白的表达，与阴性对照组和空白对照组相比，miR-99a inhibitor组RECK蛋白明显上调，MMP-2和MMP-9蛋白分别下调，差异有统计学意义(P＜0.05，图 6)。

图 6(Figure 6)

图 6 miR-99a抑制物转染对骨肉瘤143B细胞RECK、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响 miR-99a：miR-99a inhibitor组; NC：阴性对照组; Blank：空白对照组

同大多数恶性肿瘤转移机制类似，骨肉瘤细胞的转移需从细胞脱离原发病灶开始，然后进入血液及淋巴系统，逃避体内清除机制，最终进入特定的组织器官，逐渐增殖并形成转移病灶。miRNA是一种内源性、非编码的小片段RNA，近年来研究发现，miRNA可能作为诊断肿瘤以及评估骨肉瘤细胞转移的一个新的指标^[9]。

本研究首先采用RT-PCR技术检测了miR-99a在骨肉瘤组织与瘤旁骨组织中的相对表达量，miR-99a在骨肉瘤组织中的相对表达量要明显高于瘤旁骨组织，从临床病理学角度发现miR-99a与骨肉瘤存在一定联系；采用RT-PCR技术检测miR-99a在骨肉瘤细胞系143B、MG-63和U2OS中的相对表达量，以人成骨细胞系hFOB1.19作为对照，结果显示，3组骨肉瘤细胞系miR-99a表达量均高于人成骨细胞hFOB1.19。2014年波士顿召开的第十届关于miRNA的大会，专门讨论miRNA在肿瘤早期诊断和预后估计中的应用前景，多项研究表明相关miRNA对胰腺癌^[10]、结直肠癌^[11]和骨肉瘤具有早期诊断价值^[12]。Mishra等^[13]认为，在恶性肿瘤组织中，致癌miRNA呈高表达，抑癌miRNA呈低表达，而且miRNA具有组织特异性，可以作为鉴别原发肿瘤和类型的重要标志物。越来越多的临床研究报道显示^[10]，某些miRNA在人血清和瘤体组织中的特异性表达。Ma等^[14]采用RT-PCR检测89个骨肉瘤患者血液循环中miR-148a表达水平，与健康人群相比显著升高，而且，miR-148a表达水平越高，骨肉瘤患者5年生存率越低。Xu等^[15]研究发现miR-9在骨肉瘤组织中表达水平高于瘤旁组织，miR-9的高表达与骨肉瘤患者的生存率呈负相关，与肿瘤转移和临床分级呈正相关。此外，Challagundla等^[16]研究显示，在肿瘤微环境中，瘤旁组织能以外泌体(exosomes)的形式分泌miRNA，这些外泌体肿瘤细胞周围的免疫细胞吞噬，然后与Toll样受体结合，激活IL-6和TNF-α，从而促进肿瘤的增殖和转移。

本课题研究还发现，下调骨肉瘤细胞miR-99a水平后，骨肉瘤细胞的侵袭转移能力得到显著抑制，而凋亡未得到明显抑制，这提示，骨肉瘤细胞中的miR-99a高表达水平与其侵袭转移密切相关。下调miR-99a后，143B细胞中的RECK蛋白上调，而MMP-2和MMP-9蛋白表达下调。RECK(reversion-inducing cysteine-rich protein with kazal motifs)基因是一种恶性肿瘤转移抑制剂，也是一种转录后水平的基质金属蛋白抑制剂，可以通过抑制多种MMPs表达，阻碍肿瘤细胞的发生和发展。关于调控miRNA后对肿瘤细胞抑制作用机制研究已经有很多文献报道。基因学分析结果显示，miRNA-99a可显著的抑制乳腺癌细胞的增生、转移及浸润。而且生物信息学分析提示HOXA1 mRNA是miRNA-99a行使功能的直接靶基因，并通过荧光素酶标记试验得到证实。Li^[4]等研究表明，miR-99a在肝癌细胞中呈现低表达，这种低表达现象与肝癌患者预后密切相关，Jiang等^[6]证实卵巢癌细胞株FGFR3中miR-99a呈现低表达，且其低表达促进了FGFR3侵袭转移能力，本研究发现miR-99a在骨肉瘤细胞中的生物学作用与这些研究的结果相似，均证实miR-99a具有促进肿瘤细胞侵袭转移的作用，且与患者预后密切相关，当反向调控其表达后，肿瘤细胞生物学作用得到抑制。

结合以上研究及本课题组研究，不难发现，miR-99a在骨肉瘤细胞中高表达，在其他癌症细胞株中呈现低表达。并且RECK及MMP-2、MMP-3等通路蛋白可能在miR99a-inhibitor抑制骨肉瘤侵袭转移机制中起到重要作用。但是，miR-99a在骨肉瘤组织中是否为特异性高表达仍需进一步实验研究证实。