负压封闭引流(vacuum-assisted closure, VAC)在创面的治疗中应用得越来越广泛，临床疗效也越来越得到同行专家的认可^[1]。国内外学者已大量开展了基础和临床研究，但总的来说，其作用机制仍然不完整不系统，而且这些研究仅限于组织水平，很少有涉及分子机制。既然封闭负压引流技术可以促进创面的愈合，我们假设其作用机制与改变创面中黏附分子的表达有很大的关系。因此我们构建猪的感染创面的动物模型，以负压封闭引流治疗作为实验组，以传统无菌纱布覆盖作为对照组，来探讨应用VAC治疗过程中创面中细菌数量、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、P-选择素(P-selectin)和E-选择素(E-selectin)的表达的变化，来揭示VAC对创面治疗作用的部分分子机制。

6只试验用小白猪适应性喂养3 d，常规消毒后在背部脊柱两侧各旁开3 cm处，由前至后制备6个2 cm×5 cm的全层皮肤缺损创面(每侧3个)。每个创面依次植入1×10⁹/L金黄色葡萄球菌均匀菌液2 ml，分6点注射，生理盐水纱布填塞创面, 无菌敷料覆盖创面。72 h后对创面进行简单处理，修剪坏死组织。36个创面随机分为2组，每组18个创面。传统无菌纱布覆盖者设为对照组。实验组进行VAC覆盖手术，保持吸引压力为-150 mmHg。以上各实验动物均单笼饲养，术后给予肌肉注射亲霉素20万U。避免其他污染和贴膜破损漏气。实验过程中一旦出现VAC贴膜漏气或者压力不稳定的时候，立即进行调整或者小手术修复，保证实验数据的真实性和完整性。

实验组创面于VAC治疗后1, 3, 7, 14 d行VAC更换。VAC治疗14 d后均给予无菌纱布覆盖并绷带包扎。对照组在相同时间行换药治疗，同时每次手术或换药时各创面切取1块约为2 mm×5 mm×10 mm肉芽组织，分为3份。1份放入无菌试管做细菌计数用，2份冻存于-80 ℃冰箱保存备用。

术后3, 7, 14 d观察创面分泌物和肉芽组织生长情况，测量创面面积，计算创面愈合率(愈合率=原始创面面积－当前创面面积/原始创面面积)。比较创面恢复时间。

VAC治疗后0, 1, 3, 7, 14 d取创面中心的组织称重后每管中加入99倍组织重量的无菌生理盐水, 放入玻璃匀浆器中匀浆。每管匀浆液按10倍倍比稀释(10×，100×，1 000×等滴度)。每个滴度取100 μl稀释液接种到10 cm的血琼脂糖平板上，37 ℃温箱孵育24 h。查找合适滴度后，计数平板上的细菌菌落数。同时对标本进行定性检测(该步骤由本院检验科完成)。计算每克组织的细菌量, 即集落形成单位(CFU)。

将第3天及第7天备用标本(-80 ℃冻存组织)解冻后，蛋白提取、离心、SDS-PAGE电泳、转膜选择按比例稀释的的兔抗猪ICAM-1，VCAM-1，P-selectin，E-selectin作为一抗进行Western Blot检测。成像后应用Image J图像软件进行分析。同时使用细胞黏附分子相关因子蛋白芯片来分析备用的肉芽组织中ICAM-1，VCAM-1，P-selectin，E-selectin蛋白表达量。

应用SPSS 16.0软件，计量数据用均数±标准差(x±s)，计量资料的比较用Student′s t检验，计数资料的比较用χ²检验。以P＜0.05作为差异有统计学意义的标准。

术后3, 7, 14 d观察创面，见实验组创面分泌物均少于对照组，肉芽组织新鲜，质量明显好于对照组(见图 1)。创面愈合率情况如表 1；创面恢复时间实验组小于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。

图 1(Figure 1)

图 1 两组创面大体观 A.实验组第7天创面；B.实验组第14天创面；C.对照组第7天创面；D.对照组第14天创面。实验组肉芽组织渗出物少，肉芽组织新鲜；对照组肉芽组织陈旧，渗出物较多

表 1(Table 1)

表 1 两组创面愈合率的比较 组别 创面愈合率(%) 创面愈合时间(d) 3 d 7 d 14 d 实验组 19.5±3.2 39.9±11.5 76.5±16.1 19.5±2.3 对照组 10.3±3.9 26.5±10.7 56.1±13.5 23.2±3.4 P 0.045 0.036 0.028 0.014

表 1 两组创面愈合率的比较

在术后应用VAC治疗前(0 d)，所有36个创面感染的细菌密度为每克组织7.2×10⁹ CFU，表明感染创面模型制作成功；与对照组比较，实验组治疗后，创面的细菌数量显著减少(见表 2)。在VAC治疗7 d后，实验组的创面细菌数减少到每克组织10⁵ CFU以下。对照组创面细菌数量仍然高于每克组织10⁵ CFU。所有创面在治疗14 d时创面均未检测出细菌。

表 2(Table 2)

表 2 细菌计数结果 组别 0 d细菌数 (105 CFU/g) 3 d细菌数 (105 CFU/g) 7 d细菌数 (105 CFU/g) 实验组 13.5±1.5 3.8±0.7 0.7±0.08 对照组 12.9±1.7 9.6±1.7 1.8±0.32 P 0.76 0.009 0.001

表 2 细菌计数结果

应用Western Blot方法检测创面肉芽组织中ICAM-1，VCAM-1，P-selectin，E-selectin的表达。在各检测时间点ICAM-1，VCAM-1，P-selectin，E-selectin的表达量实验组均高于对照组(见表 3、图 2)。在创面治疗后3 d，实验组ICAM-1、VCAM-1、P-selectin表达显著高于对照组，差异有统计学意义，而E-selectin的差异则无统计学意义。在第7天时，ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的表达实验组显著显著高于对照组，差异有统计学意义，而P-selectin的表达差异则无统计学意义。肉芽组织经过蛋白芯片技术检测，其结果见图 3及表 4，其结果与Western Blot结果一致。

表 3(Table 3)

表 3 黏附分子的相对表达量 组别 ICAM-1 VCAM-1 P-selectin E-selectin 3 d 7 d 3 d 7 d 3 d 7 d 3 d 7 d 实验组 35.0±2.3 48.0±3.1 46.0±2.5 78.0±5.1 76.0±5.3 78.0±6.5 44.0±2.1 89.0±5.3 对照组 24.0±1.6 33.0±2.9 32.0±2.1 56.0±3.9 46.0±3.2 69.0±6.9 38.0±2.6 55.0±3.6 P 0.024 0.031 0.015 0.017 0.007 0.145 0.231 0.003

表 3 黏附分子的相对表达量

图 2(Figure 2)

图 2 Western Blot方法检测创面肉芽组织中ICAM-1，VCAM-1，P-selectin，E-selectin的表达印迹图片

图 3(Figure 3)

图 3 各组蛋白芯片免疫印迹图 以上每图每四个点代表一个因子，每组中第一行均为标准参照品，由上至下依次为ICAM-1，VCAM-1，P-selectin，E-selectin蛋白芯片印记图片

表 4(Table 4)

表 4 两组创面肉芽组织中各黏附分子在术后不同时间蛋白芯片印迹经PeriScan PIM 3 system软件分析后表达量 黏附分子 第3天 P 第7天 P 对照组(n=20, pg/ml) 实验组(n=20, pg/ml) 对照组(n=20, pg/ml) 实验组(n=20, pg/ml) ICAM-1 229.5±73.4 488.3±80.2 0.008 225.6±24.4 417.5±87.4 0.006 VCAM-1 187.5±104.7 346.9±140.5 0.006 113.7±14.2 247.5±40.3 0.014 P-selectin 168.9±13.8 96.4±17.4 0.001 68.9±3.7 76.4±5.9 0.231 E-selectin 314.9±1418 331.0±11.5 0.241 117.9±12.1 207.1±19.8 0.019

表 4 两组创面肉芽组织中各黏附分子在术后不同时间蛋白芯片印迹经PeriScan PIM 3 system软件分析后表达量

本实验在猪背部制作的皮肤缺损，面积已经超过直径为18 mm的创面，可有效排除其自然愈合的干扰。且本实验中再切除皮肤同时，连同皮下组织、甚至深筋膜层一并切除，也是为了模拟临床中清创后的实际情况，保证肉芽组织的顺利生长。因此本实验模型实现了模拟临床感染创面联合软组织缺损的方案，确保了实验的有效性。付小兵^[2]报道组织创面细菌量高于3×10⁸ CFU/ml时创面才会出现感染，且随着浓度的增大，感染越明显。本实验使用细菌量为2 ml浓度为5×10⁹ CFU/ml标准金葡菌液滴注，最后形成创面均有明显的脓性分泌物，且伴有红肿热痛征象，细菌计数的结果也进一步证实感染创面造模成功。

VAC可以有效地减少创面感染，其主要机制可能与治疗过程中创面局部形成的密闭、潮湿环境为机体免疫细胞发挥其功能有关。Shin等^[3]发现VAC特有的密闭、潮湿环境为多形细胞介导的宿主吞噬细胞发挥功能提供了非常有利的条件，同时敷料下收集到的液体中有多形核白细胞、淋巴细胞等多种免疫细胞，说明这种密闭、潮湿的环境相比传统的纱布敷料而言，能为免疫细胞发挥其吞噬、杀灭细菌的功能提供更好的局部环境，从而有助于创面感染的预防。用VAC处理创面使泡沫-创面界面处细胞聚集，导致细胞发生微形变^[4]。体内试验表明创面细胞微形变可以诱导细胞增殖和分化、促进血管形成。本项研究显示，经VAC处理之后的创面细菌清除更快更彻底，感染早期就得到控制。

创面的愈合是一个综合的过程，它涉及到一系列复杂的生物化学和细胞学反应，包括止血、炎症反应、增殖和重塑等过程^[4]。黏附分子作为细胞外基质很重要的一个组成部分，其在创面愈合中的作用十分重要。他们不仅可以调节细胞与细胞之间的相互作用，而且也可以通过引起调节细胞与基质之间的反应来促进创面的愈合^[5]。ICAM-1和VCAM-1都是免疫球蛋白超家族的黏附分子，他们在正常的内皮细胞内维持着较低的水平，一旦炎症反应开始时，其表达水平迅速上升。P-selectin是既定形式合成和储存于血小板内皮细胞或Q颗粒内的，他们的迅速激活和迁移是机体炎症反应的主要参与者。E-selectin是需要由从头途径来合成的，产生之后至少会持续8-12 h。Mahmoudi ^[6]等的研究指出，E-selectin必须参与细胞内信号转导途径，从而促进结构致密的细胞骨架的形成。炎症反应期主要是由P-selectin和E-selectin介导，他们可以强力的黏附血小板，使细胞变得松散，促进炎症因子的释放和聚集。在炎症反应后期和细胞增殖期，ICAM-1和VCAM-1可以促进巨噬细胞和内皮细白的激活，通过促炎症因子的释放，使炎症反引期到达高峰，同时引导细胞增殖期的开始。在细胞增殖期末，ICAM-1和VCAM-1能够促进胶原蛋白的沉积，同时作用于血管加速其成熟，启动组织重塑。负压的存在使创面周围组织的氧分压下降，刺激创面的修复信号，机体开始分泌纤溶蛋白激活物和其他酶类，促进创面纤维蛋白溶解，从而产生自溶性清创^[7]。经VAC处理后的组织内的原癌基因c-fos和基质金属蛋白酶MMPs等的表达量均有所下降，同时c-fos表达的减少又能够部分或完全地阻断MMPs的表达，从而保护了创面周围组织里的胶原成分，大大的减少了胶原蛋白的丢失，促进了慢性创面的愈合^[8]。本研究中ICAM-1，VCAM-1，P-selectin，E-selectin在经过VAC处理后期表达量在创面治疗的第3天及第7天均较对照组大，术后3 d，实验组ICAM-1、VCAM-1、P-selectin表达显著高于对照组，差异有统计学意义，而E-selectin的差异则无统计学意义。在第7天时，ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的表达实验组显著显著高于对照组，差异有统计学意义，而P-selectin的表达差异则无统计学意义。由于蛋白芯片技术具有高通量、高灵敏度、高准确度的优势，而且操作起来简便易行，因此借助此技术来检验Western Blot试验结果，两者一致，因此此结果更加可靠。根据此结果，我们推测ICAM-1、VCAM-1参与创面愈合的三个过程，而P-selectin主要参与早期的创面愈合，E-selectin则在创面愈合晚期发挥更明显的作用。至于其引起变化的具体机制目前还没有相关的研究，我们希望能够在今后的研究中发现引起这一现象的机制。