α-半乳糖神经酰胺(α-galactosylceramide，α-GalCer)是从植物海绵中提取的糖脂类抗原，可以在体内外特异性活化恒定自然杀伤T细胞(invariant nature killer T cells, iNKT cells)^[1]。研究显示α-GalCer可以增强卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)诱导的哮喘小鼠过敏性气道炎症^[2]，但机制并不清楚。肺树突状细胞(lung dendritic cells，LDCs)可以诱导原始CD4⁺T细胞分化为Th2细胞，启动和维持哮喘Th2反应^[3]。因此，本实验观察α-GalCer对OVA诱导的哮喘小鼠LDCs表面分子和分泌细胞因子水平的影响，初步探讨其与α-GalCer活化iNKT的关系。

6周龄健康雌性野生型BALB/c小鼠购自武汉大学实验动物中心，在无特定病原菌(SPF)环境饲养。卵清白蛋白(OVA，Grade Ⅴ)购于美国Sigma公司；免疫佐剂氢氧化铝凝胶购于美国Thermo公司；α-GalCer购于Enzo公司；Ⅰ型胶原酶购自Invitrogen公司；亲和素连接的辣根过氧化物酶、Brefeldin A、FITC标记的IFN-γ和IL-4、PE-Cy5标记的TCR-β和同型阴性对照、PE-Cy5标记的F4/80、APC-Cy7标记的CD11c、PE标记的MHC Ⅱ、CD40、CD80和CD86、链霉亲和素连接的PE、ELISA试剂盒(IL-12p70、IL-10、IL-6、TNF-α)、固定剂和破膜剂均购于美国eBioscicence公司；CD11c磁珠购于美国Miltenyi公司；PE标记的未负载的小鼠CD1d四聚体和PE标记的PBS-57/小鼠CD1d四聚体由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)赠送。

24只野生型BALB/c小鼠[体重(20±1)g]按随机数字表法分正常对照组、哮喘组和哮喘α-GalCer组，每组8只。哮喘组和哮喘α-GalCer组小鼠第0、14天腹腔注射OVA 20 μg (含氢氧化铝佐剂2 mg)，第25、26和27天腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，以OVA 100 μg滴鼻激发，健康对照组使用等体积PBS替代。哮喘α-GalCer组小鼠于第25天激发前1 h腹腔注射α-Galcer 2 μg，健康对照组和哮喘组小鼠腹腔注射等体积PBS替代。

末次激发24 h后取各组小鼠肺组织，充分切碎，Ⅰ型胶原酶(1 mg/ml)37 ℃消化1 h后以50 μm细胞滤网过滤，随后使用红细胞裂解液裂解红细胞，收集肺单细胞混悬液，采用密度梯度离心法分离获得肺单个核细胞，调整细胞浓度为(5-10)×10⁹个/L。

取100 μl肺MNCs混悬液于离心管中，加入抗小鼠CD16/CD32抗体，4 ℃，避光，30 min。加入PE标记的PBS-57/CD1d四聚体复合物，将PE标记的未负载的小鼠CD1d四聚体加入对照管中作为阴性对照，4 ℃，避光，50 min；随后加入PE-Cy5标记的TCR-β，对照管中加入PE-Cy5标记的IgG₁作为阴性对照，4 ℃，避光，20 min，使用PBS液洗涤细胞1次，以0.5 ml PBS重悬细胞，上机检测PBS-57/CD1d⁺ TCR-β⁺细胞，即为iNKT细胞。细胞内细胞因子染色时，肺MNCs经依诺霉素(500 μg/L)和佛波酯(50 μg/L)刺激培养2 h，随后加入1 mg/L Brefeldin A继续刺激2 h，收集细胞，同上染色之后固定破膜，加入FITC标记的INF-γ或FITC标记的IL-4，对照管加入FITC标记的IgG₁作为阴性对照，室温，避光，20 min。破膜剂1-2 ml洗涤细胞1次，重悬细胞至0.5 ml PBS中，上机检测。

取100 μl肺MNCs混悬液于离心管中，加入抗小鼠CD16/CD32抗体，4 ℃，避光，30 min。分别加入APC-Cy7标记的CD11c、PE-Cy5标记的F4/80，分别向对照管中加入相应的同型阴性对照，4 ℃，避光，30 min，随后分别加入PE标记标记的MHC-Ⅱ、CD40、CD86、CD80或相应的同型阴性对照，4 ℃，避光，30 min，PBS液洗涤2次，重悬细胞到0.5 ml PBS中，上机检测。

肺树突状细胞表面表达CD11c分子，不表达F4/80分子，因此以CD11c⁺F4/80^-细胞标记肺树突状细胞^[4]。采用磁珠分选法联合流式细胞仪分选肺树突状细胞。首先参考试剂说明书采用磁珠分选小鼠肺单个核细胞中CD11c⁺细胞，随后以FACS重悬CD11c⁺细胞于离心管中，加入APC-Cy7标记的CD11c和PE-Cy5标记的F4/80，4 ℃，避光，30 min；采用流式细胞仪分选并收集CD11c⁺F4/80^-DCs，即肺树突状细胞(纯度大于99%)。随后使用96孔培养板，采用RPMI 1640完全培养基，内含有10%热灭活FBS、1 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L L-谷氨酰胺、50 U/ml青霉素和25 μg/ml庆大霉素，每孔加入LDCs 2×10⁵个，在存在OVA (100 μg/ml)或等体积PBS下培养72 h，收集培养上清液，采用ELISA法检测培养上清液IL-12p70、IL-10、IL-6和TNF-α水平，检测方法参考试剂说明书。

应用SPSS 20.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差(x±s)表示，各组间比较采用独立样本t检验或单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

哮喘组小鼠肺iNKT占肺MNCs百分比与哮喘α-GalCer组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，但与正常对照组比较差异亦有统计学意义(P＜0.01)(图 1，表 1)；以分泌细胞因子水平表示肺iNKT的活性，哮喘组小鼠肺IL-4⁺和IFN-γ⁺iNKT细胞占肺iNKT细胞百分比与哮喘α-GalCer组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，但与正常对照组比较差异亦有统计学意义(P＜0.01)(图 2，表 1)。

图 1(Figure 1)

图 1 各组肺iNKT细胞占肺单个核细胞的百分数比较 D门中的百分数表示肺iNKT细胞(TCRβ+PBS-57/小鼠CD1d四聚体+细胞)占肺单个核细胞的百分数

图 2(Figure 2)

图 2 各组肺IL-4+和IFN-γ+iNKT细胞占肺iNKT细胞的百分数比较 横线上百分数分别表示IL-4+和IFN-γ+iNKT细胞占肺iNKT细胞的百分数

表 1(Table 1)

表 1 各组小鼠肺iNKT细胞、IL-4+和IFN-γ+ iNKT细胞百分数的比较(x±s，%) 组别 n iNKT cells/MNCs IL-4+ iNKT cells/iNKT cells IFN-γ+ iNKT cells/iNKT cells 正常对照组 8 0.67±0.24 14.84±2.51 15.07±3.71 哮喘组 8 1.21±0.20Δ 36.51±2.97Δ 25.58±5.83Δ 哮喘α-GalCer组 8 1.68±0.22Δ# 41.30±3.52Δ* 34.5±6.27Δ* MNCs：肺单个核细胞；与正常对照组比较，ΔP＜0.01；与哮喘组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

表 1 各组小鼠肺iNKT细胞、IL-4+和IFN-γ+ iNKT细胞百分数的比较(x±s，%)

以MHC-Ⅱ⁺、CD40⁺、CD86⁺和CD80⁺LDCs占肺LDCs百分比表示LDCs表型成熟水平^[6]。哮喘组小鼠LDCs表面分子MHC-Ⅱ、CD40、CD86和CD80表达水平与哮喘α-GalCer组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，但与正常对照组比较差异亦有统计学意义(P＜0.01)(图 3，表 2)。

图 3(Figure 3)

图 3 各组LDCs表面分子表达水平的比较 横线上百分数分别表示MHC-Ⅱ +、CD40+、CD86+和CD80+LDCs占肺LDCs的百分数

表 2(Table 2)

表 2 各组小鼠LDCs表面分子表达水平的比较(x±s，%) 组别 MHC-Ⅱ+/LDCs CD40+/LDCs CD86+/LDCs CD80+/LDCs 正常对照组 63.0±26.5 27.5±12.7 8.5±3.8 18.8±7.5 哮喘组 83.7±32.4Δ 60.5±26.6Δ 25.8±13.0Δ 32.2±13.5Δ 哮喘α-GalCer组 91.3±35.2Δ# 69.3±28.1Δ# 37.2±16.5Δ# 41.8±19.2Δ# 与正常对照组比较，ΔP＜0.01；与哮喘组比较，#P＜0.01

表 2 各组小鼠LDCs表面分子表达水平的比较(x±s，%)

以LDCs体外培养上清液IL-12p70、IL-6、TNF-α和IL-10水平表示LDCs功能成熟水平^[6]。哮喘组小鼠LDCs培养上清液IL-12p70、IL-6和TNF-α水平与哮喘α-GalCer组比较差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)，但与正常对照组比较差异亦有统计学意义(P＜0.01)。哮喘组小鼠LDCs培养上清液IL-10水平与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，但与哮喘α-GalCer组比较差异无统计学意义(表 3)。

表 3(Table 3)

表 3 各组小鼠LDCs体外培养上清液中细胞因子水平的比较(x±s，pg/ml) 组别 IL-12p70 IL-6 TNF-α IL-10 正常对照组 0 0 0 0 哮喘组 190.5±50.3Δ 1 252.7±326.6Δ 242.6±71.4Δ 18.2±4.8Δ 哮喘α-GalCer组 293.8±85.9Δ* 2 425.8±584.8Δ# 1 080.2±278.2Δ# 16.8±4.1Δ 与正常对照组比较，ΔP＜0.01；与哮喘组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

表 3 各组小鼠LDCs体外培养上清液中细胞因子水平的比较(x±s，pg/ml)

α-半乳糖神经酰胺是糖脂类抗原，其为iNKT细胞的特异性配体，可以特异性活化iNKT细胞，使其参与免疫调节作用^[1]。传统观点认为哮喘由肽类抗原诱发，但研究显示α-GalCer可以增强卵清蛋白诱导的哮喘小鼠过敏性气道炎症^[2]，提示脂类抗原与哮喘发病相关，但机制并不清楚。本研究以α-GalCer干预OVA诱导的哮喘小鼠模型，结果发现α-GalCer可以增加哮喘小鼠LDCs表面分子的表达水平和促炎性细胞因子的分泌水平，同时发现哮喘小鼠肺iNKT细胞活化，提示α-GalCer可能通过活化iNKT细胞促进LDCs表型和功能成熟。

树突状细胞分为不成熟和成熟树突状细胞^[5]。DCs表型成熟与其表面分子如CD80、CD86、CD40和MHC-Ⅱ表达水平有关，而功能成熟与其分泌细胞因子水平和类型有关。不成熟DCs低表达MHC-Ⅱ分子以及共刺激分子如CD80、CD86、CD40等，不产生或产生少量促炎性细胞因子，如IL-12、IL-6和TNF-α等；不成熟DCs可以诱导T细胞无能。因此，不成熟DCs被认为是耐受原性DCs^[5]。与之相反，成熟DCs表面分子表达水平上调，产生促炎性细胞因子，而免疫负相调节因子如IL-10分泌水平下降；成熟DCs可以诱导原始T细胞增殖分化。因此，成熟DCs被认为是免疫原性DCs^[5]。本研究发现，野生型小鼠LDCs低表达MHC-Ⅱ、CD40、CD86、CD80等表面分子，低分泌促炎性细胞因子，但是IL-10分泌水平较高，提示野生型小鼠LDCs是不成熟DCs。哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性细胞因子表达水平增高，但IL-10分泌水平降低，提示哮喘小鼠LDCs是成熟DCs；进一步观察发现，α-GalCer可以增加哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性细胞因子的表达水平，进一步降低IL-10的产生水平，提示α-GalCer可以增加哮喘小鼠LDCs的成熟水平。目前认为肺树突状细胞是诱导哮喘Th2反应的中心环节^[3]，因此我们推测α-GalCer增强卵清蛋白诱导的哮喘小鼠气道炎症可能与其增强肺树突状细胞的成熟水平有关。研究报道α-GalCer活化iNKT细胞通过调节DCs的功能可以增强CD4⁺和CD8⁺T细胞对可溶性肽类抗原的免疫反应^[6]。本研究显示，哮喘小鼠肺iNKT细胞明显活化，表现为肺iNKT细胞占肺MNCs的百分比明显增高，分泌细胞因子IL-4和IFN-γ水平明显增加。因此我们推测，α-GalCer可能通过活化iNKT细胞调节LDCs的功能，但需进一步的研究。

α-GalCer活化肺iNKT细胞增加哮喘小鼠LDCs成熟水平的机制尚不清楚。研究认为DCs表达分子CD40与其配体CD40L(CD40 ligand)相互作用是诱导其成熟的机制之一^[7]。本实验显示α-GalCer可以增加哮喘小鼠LDCs表面CD40表达水平。研究显示，抗原激活的iNKT细胞可以上调细胞表面CD40L的表达水平^[8]。因此，我们推测α-GalCer活化iNKT细胞可能通过CD40-CD40L途径促进LDCs成熟，但需进一步的研究。

综上所述，α-GalCer可以增加OVA诱导的哮喘小鼠LDCs表面分子表达水平和促炎细胞因子分泌水平，这可能与其活化肺iNKT细胞有关。