鼻咽癌是耳鼻咽喉头-颈外科最常见的恶性肿瘤之一。鼻咽癌具有非常独特的地理分布模式^[1]，它在中国华南地区及东南亚地区普遍发生，然而在其他地区较少出现，这一现象目前还没有发现明确的原因^{[2, 3]}。

miRNA(或miR)是一类长度约18-25个核苷酸的小分子单链RNA具有调控功能的、内源性的、高度保守的非编码单链RNA。miRNA主要作用机制是通过与特异性靶分子mRNA序列(主要位置为3′非翻译区，3′-UTR)结合，引起特异性靶分子mRNA的降解或者抑制基因转录后翻译等，从而调控多种细胞生物学过程^[4]。miRNA的生物合成过程及作用机制主要为：核内转录生成长度约为300-1 000 bp的初级miRNA，初级miRNA进一步由RNA酶Drosha加工成长度约为70-90 bp的miRNA前体，转运蛋白Exportin5主动将miRNA前体运输至细胞质，RNA核酸内切酶Dicer识别miRNA前体，并将其剪切成约22 bp的双链RNA，解链后生成成熟的单链miRNA，成熟的miRNA与RNA沉默诱导复合体结合并作用于靶mRNA的3′或5′非翻译区。当miRNA与特异性靶分子mRNA序列完全互补配对时，miRNA会导致靶mRNA的降解。当miRNA与特异性靶分子mRNA序列配对不完全时，miRNA会抑制靶mRNA的蛋白翻译^{[5, 6]}。

我们前期筛选得到了在鼻咽癌癌组织和癌旁组织表达差异显著的miR-1275，本研究旨在初步探讨miR-1275在鼻咽癌中的作用。

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养正常鼻咽上皮细胞系NP69及鼻咽癌细胞系CNE-1细胞，置于37 ℃恒温培养箱培养。依实验要求对NP69及CNE-1细胞进行处理。

2×PCRMIX(北京康为世纪生物科技有限公司)；2×实时荧光定量PCRMIX(日本TaKaRa公司)；DEPC水(碧云天生物技术公司)；HiFiScriptcDNA第一链合成试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；PCR引物(武汉擎科创新生物科技有限公司)；TRIzol(美国Invitrogen公司)。

提取新鲜组织或者鼻咽癌细胞系RNA后运用HiFiScriptcDNA第一链合成试剂盒逆转录成cDNA，miR-1275采用All-in-one^TMmiRNA qPCR检测试剂盒进行反应，以U6作为内参照。靶基因采用SYBR-GreenPCRMasterMix进行反应，以GAPDH作为内参照。靶基因HOXB5引物序列，上游引物：5′-TCAGCCATGATATGACCGGG-3′，下游引物：5′-AGATCTTGATCTGGCGCTCG-3′。

本研究选择常用的miRNA靶基因在线预测网站TargetScan(www.targetscan.org)预测miR-1275-3p的靶基因。TargetScan通过查找mer位点与miRNA的种子区域的匹配来预测靶基因，故只有保守的位点可以被预测到。在哺乳动物中，通过位点的累积加权分数对预测出来的靶基因的靶向性进行排序^[7]。

双荧光素酶报告分析操作依照luciferase检测操作手册进行。

将CNE1细胞依据分组分别接种在96孔板中，每孔接种浓度约1×10⁴个细胞，置于含5%CO₂，37 ℃恒温箱中进行正常培养。每组中的实验重复进行3次，并且设立空白对照。各组中依实验要求加入miR-1275模拟物，HOXB5 siRNA。分别培养0, 24, 48和72 h后，加入10 ml CCK-8，37 ℃孵育1 h，450 nm处检测吸光度值。

实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 16.0统计软件对数据进行检验，以P＜0.05视为具有统计学差异。

提取正常鼻咽上皮细胞系NP-69细胞及鼻咽癌细胞系CNE-1细胞RNA，检测两组细胞中miR-1275中的表达水平。以miR-1275在NP-69细胞中的表达水平为标准，miR-1275在CNE-1中的相对表达量为0.37±0.01，且具有统计学意义(P＜0.05，图 1)。结果提示，在鼻咽癌细胞系中miR-1275表达下调。

图 1(Figure 1)

图 1 miRNA在NP-69及CNE-1细胞中的表达水平 *与NP-69相比，P＜0.05

我们在几个数据库，包括PicTar，microRNA.org和TargetScan中寻找miR-1275的靶基因，其中HOXB5 3′-UTR的929-947处含有保守的miR-1275同源位点(图 2A)，因此最终选择了在多种肿瘤细胞中高表达的癌基因HOXB5作为miR-1275的靶基因。随后的双荧光素酶报告分析实验结果显示，质粒转染HOXB5野生型3′-UTR载体在miR-1275模拟物刺激下萤火虫荧光素与海肾荧光素的比值明显下降，而转染HOXB5突变型3′-UTR组在miR-1275模拟物刺激下萤火虫荧光素与海肾荧光素的比值无明显变化(图 2B)。提示HOXB5为miR-1275的靶基因。

图 2(Figure 2)

图 2 miR-1275与靶基因HOXB5相互作用的双荧光酶素检测结果 A: miRNA-1275与预测靶点HOXB5的结合位点; B:双荧光素酶法检测miRNA-1275与预测靶点HOXB5能靶向结合，*P＜0.05

为了进一步验证鼻咽癌细胞中miR-1275的肿瘤抑制效率，我们用空白对照，miR-1275模拟物，HOXB5 siRNA(si-HOXB5)对CNE-1细胞的作用，我们用CCK8法检测不同时间点处理CNE-1细胞的活力。与空白对照组相比较，miR-1275模拟物和si-HOXB5的处理显著减弱CNE-1细胞增殖能力(图 3)。

图 3(Figure 3)

图 3 不同时间点不同方法处理CNE-1细胞后细胞增殖能力情况

综上所述，鼻咽癌中miR-1275低表达，HOXB5高表达，且HOXB5是miR-1275的靶基因。

越来越多的研究表明，大量miRNA在鼻咽癌的发生发展中起到关键作用。Luo^[8]发现在鼻咽癌中有48个miRNA异常表达，而这些miRNA大多与细胞增殖、细胞基质黏附和细胞迁移有关。同时这48个miRNA的靶基因参与细胞黏附和p53信号通路等。miR-135b-5p、miR-205-5p、miR-93-5p、miR-650以及miR-183-5p可以作为初发鼻咽癌的新的诊断指标^[9]。然而不同miRNA在鼻咽癌发生发展中的作用不尽相同。例如miR-233可以靶向MAFB来抑制鼻咽癌细胞的增殖和迁移^[10]；miR-4649-3p可以靶向蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制鼻咽癌细胞的增殖^[11]；而miR-142-3p可以抑制SOCS6的表达来促进鼻咽癌细胞的增殖^[12]；miR-29a/b通过调节SPARC和COL3A1的表达水平来促进鼻咽癌细胞的迁移和侵袭^[13]。MiR-204在鼻咽癌患者血清中表达下调，其表达与鼻咽癌患者的EB病毒感染、肿瘤的分化程度、淋巴结转移和TNM分期明显相关；同时鼻咽癌患者组织中miR-204低表达者生存时间明显低于高表达者^[14]。

HOX转录因子在胚胎发育过程中发挥着重要作用，可以决定细胞命运。大量研究表明，HOX基因参与了多种类型癌症的进展。HOXB5作为其中一员，在乳腺癌组织和细胞系中异常高表达。在ER阳性的乳腺癌细胞系中沉默HOXB5显著降低细胞增殖和侵袭^[15]。在胃癌中，HOXB5可以激活Wnt/β-catenin信号通路，促进细胞的转移。我们的实验结果表明，miR-1275在鼻咽癌细胞系中低表达，通过在鼻咽癌细胞中转染miR-1275或HOXB5 siRNA抑制鼻咽癌细胞中HOXB5从而达到抑制鼻咽癌细胞的增殖能力，说明在miR-1275的缺失导致HOXB5的高表达可能在鼻咽癌的发生发展中起到关键作用。

miRNA对靶基因mRNA的作用机制主要有三种方式：①直接降解靶基因——当miRNA与特异性靶基因编码区或非编码区完全配对，可直接降解特异性靶基因mRNA(miRNA只降解与其序列互补配对的mRNA)；②抑制特异性靶基因的翻译——当miRNA与特异性靶基因不完全互补结合时，miRNA通过阻遏特异性靶基因的翻译，而不影响特异性靶基因mRNA的稳定性，此种miRNA的作用方式种类较多；③同时包括上述两种作用方式^{[16, 17]}。miR-1275对HOXB5的具体作用机制及其具体的生物学功能非常值得进一步探讨。这为miR-1275及其靶基因HOXB5在鼻咽癌诊疗中可能发挥的作用提供了理论依据。