新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy, HIE)是指由于围生期窒息、缺氧所导致的脑缺氧缺血性损害，临床出现一系列神经系统异常的表现，是新生儿死亡和致残的重要疾病之一^[1]。目前HIE的诊断及预后判断主要依据患儿病史、症状、体征及影像学检查，没有一量化指标，对HIE的诊断、分度及预后的判断存在一定的局限，不利于动态监测病情。HIE的发病机制复杂，包括能量衰竭、氧化应激及细胞凋亡等，目前仍未完全清晰。有研究报道细胞凋亡参与了缺氧缺血性脑损伤的发病过程^{[2, 3]}，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)是细胞凋亡的主要执行者。还有研究发现，HIE模型鼠脑组织中Caspase-3活性增加^{[4, 5]}。国内外利用氢质子磁共振波谱技术(¹H-MRS)测量HIE脑组织的代谢产物，揭示其病理生理变化的研究较多，未见同时在HIE患儿中测定血清Caspase-3及脑代谢产物。本研究动态监测不同程度HIE患儿血清Caspase-3水平，并探讨血清Caspase-3水平与脑组织代谢产物的相关性，为监测HIE病情，判断病情程度提供理论依据。

选取2013年11月至2015年8月新生儿科住院的HIE患儿57例，其中轻度HIE患儿23例，中度HIE患儿18例，重度HIE患儿16例，轻、中、重度组HIE患儿的体重、胎龄无统计学差异。纳入标准：诊断及分度标准严格参照2005年中华医学会儿科学分会新生儿学组制定的“新生儿缺氧缺血性脑病诊断标准”，由2名有经验的新生儿科医师完成，胎龄37-42周，体重2.5-4 kg，排除颅内感染、新生儿核黄疸、新生儿低钙抽搐、神经系统发育异常(如颅骨裂、脊柱裂、先天性脑积水、小头畸形)和遗传代谢性疾病，否认孕母吸毒史。均经过医院医学伦理委员会批准，家长知情同意。

同期生后24 h内入住新生儿科，无明确的宫内窘迫史，出生时无窒息史，生后临床无缺氧表现，无严重营养不良、先天畸形和遗传代谢性疾病，否认孕母吸毒史，血气分析及血乳酸结果正常的头皮血肿、新生儿黄疸、湿肺、肺炎和肠道疾病足月新生儿20例为对照组，均经过医院医学伦理委员会批准，家长知情同意。对照组患儿与病例组患儿的体重、性别、胎龄无统计学差异。

所有试验对象均于生后24 h、3 d、7 d经静脉穿刺取血1 ml，然后将血标本置于玻璃试管内，2 h内2 000 r/min离心15 min，用移液器取上层血清0.2 ml置于聚乙烯管中，-20 ℃保存待测。血清Caspase-3检测试剂盒购于上海星科生物科技有限公司，血清Caspase-3检测采用双抗体夹心ELISA法，严格按照说明书操作。

头部MRI于生后10 d内检查，MRI及MRS检查采用美国GE公司生产的1.5T超导型磁共振扫描系统。所有患儿熟睡后检查，必要时水合氯醛口服或者保留灌肠镇静，常规耳塞和耳罩消除声音干扰，头部海绵固定。常规MR扫描完成后行¹H-MRS检查，结合横切位和冠状位扫描确定感兴趣区为双侧基底核、丘脑及额顶叶白质区，测定代谢物氮-乙酰天门冬氨酸(NAA)、肌酸(Cr)、胆碱(Cho)以及乳酸(Lac)共振峰峰下面积。

所有结果采用双盲法评价，由2名不知道临床表现的高年资放射科医师分析60例患儿的头颅MRI及¹H-MRS数据，对不同结果结合临床病史进行讨论，达一致意见。代谢物分析在工作站上采用MRS专用软件进行分析，Cr水平在脑内不同代谢环境下总量较稳定，以Cr作为参照波峰，测量各代谢物共振峰峰下面积及比值。

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示(x±s)，两样本数据均采用独立样本t检验，多组间采用多因素设计资料的方差分析，若方差不齐，采用非参数检验方法，并进行相关性分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

轻度HIE组病程各阶段的血清Caspase-3水平与健康对照组比较差异无统计学意义(24 h，3 d，7 d的P值分别为0.684，0.486，0.543)，中度HIE组和重度HIE组各阶段的血清Caspase-3水平与健康对照组比较差异有统计学意义，同阶段中度HIE组与轻度HIE组、同阶段重度HIE组与中度HIE组比较差异有统计学意义(见表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 HIE组与对照组血清Caspase-3检测结果分析(x±s，μg/L) 组别 n 24 h 3 d 7 d F P 健康对照组 20 2.76±0.54 2.83±0.56 2.81±0.53 0.26 0.876 轻度HIE组 23 3.18±0.48 3.57±0.54 3.32±0.46 2.13 0.215 中度HIE组 18 5.84±0.66 7.42±1.32 3.58±0.72 69.84 0.00 重度HIE组 16 6.79±0.96 9.36±1.37 5.56±0.86 58.93 0.00 F 62.15 98.75 56.43 P 0.00 0.00 0.00

表 1 HIE组与对照组血清Caspase-3检测结果分析(x±s，μg/L)

轻度HIE组各阶段的血清caspase-3比较差异无统计学意义，中度HIE和重度HIE组血清Caspase-3水平先升高，后下降，24 h与3 d、3 d与7d差异有统计学意义(见表 1)。

对照组与HIE组及HIE各组间的NAA/Cr、Lac/Cr比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；对照组与HIE组及HIE各组间的Cho/Cr比较，差异无统计学意义(见表 2)。

表 2(Table 2)

表 2 HIE组与对照组MRS检查各代谢物测定统计学分析(x±s) 组别 n NAA/Cr Cho/Cr Lac/Cr 对照组 20 2.132±0.346 2.446±0.307 0.215±0.110 轻度HIE 23 1.112±0.321 2.516±0.342 0.458±0.164 中度HIE 18 0.903±0.356 2.579±0.434 0.591±0.121 重度HIE 16 0.489±0.315 2.21±0.362 1.271±0.248 F 7.35 2.36 11.02 P ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01

表 2 HIE组与对照组MRS检查各代谢物测定统计学分析(x±s)

结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 血清Caspase-3与MRS检查各代谢物比值的相关性分析 组别 n NAA Cho Lac Cr 轻度HIE组 23 -0.178 0.312 0.212 -0.205 中度HIE组 18 -0.256 0.346 0.336 -0.216 重度HIE组 16 -0.248 0.412 0.389 -0.227

表 3 血清Caspase-3与MRS检查各代谢物比值的相关性分析

新生儿缺氧缺血性脑病的发病机制复杂，目前已知有多种机制参与其中，包括能量衰竭、再灌注损伤、氧化应激、炎性细胞因子的释放、兴奋性氨基酸的增加和细胞凋亡等。其中，细胞凋亡在缺氧缺血性脑损伤中的作用十分重要。

Caspase是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶家族，成员较多，在人类，已经鉴定了11种不同的Caspase，根据其蛋白酶序列的同源性可分为3个亚族：Caspase-1、Caspase-2、Caspase-3。它们的活性位点均包含半胱氨酸残基，能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键。Caspase-3是各种凋亡通路的必经之路，在细胞凋亡中起关键性作用。本研究结果表明，中度HIE患儿与重度HIE患儿血清Caspase-3明显升高，重度组高于中度组，中度组高于轻度组，且差异均有统计学意义，提示Caspase-3与HIE病情程度有关，且参与了HIE的病理生理过程，中度、重度HIE患儿细胞凋亡较多，脑组织损伤严重。与郭映辉^[6]等的研究结果一致。轻度HIE患儿与对照组血清Caspase-3差异无统计学意义，可能因为轻度HIE患儿缺氧缺血程度轻，神经细胞损伤轻，在机体产生相应内源性保护的作用下，细胞凋亡较少。本研究还发现，Caspase-3水平第3天较24 h高，第7天较第3天下降，提示在缺氧缺血发生后Caspase-3水平先升高后下降，与HIE的病程相关，将可作为监测HIE病程的生化指标。Caspase-3后期下降可能与HIE患儿经过治疗后细胞凋亡减少有关，预示治疗有效，可作为监测治疗疗效的指标。

氢质子磁共振波谱技术(¹H-MRS)是利用化学位移作用原理，进行一系列特定原子核及化合物定量分析，可无创性地揭示HIE病理生理变化。波峰曲线下面积与所含H质子数成正比，且磁场越强，曲线下面积越大。NAA、Cr、Cho、肌醇、谷氨酸、谷氨酰胺、脂质和乳酸在MRS中形成的波峰有显著临床意义^[7]。每个峰有助于评估大脑内特定细胞系或代谢途径。NAA仅见于神经元轴索及其胞体中，其含量变化反映了神经元的功能状况，NAA的改变通常是不可逆的，是不可逆脑损伤的标志。Cho是神经递质的重要组成部分，反映细胞膜的合成情况，Cho峰增高，反映细胞分裂增殖活跃及细胞膜代谢异常增加。Lac是葡萄糖无氧酵解的产物，Lac水平的增加是脑缺氧缺血的标志^[8]，脑内Lac水平持续不降提示预后不佳。脑内Cr的含量因在各种状态下较稳定，故常用作与其他代谢产物比较的参照物。

有研究证明，在HIE早期，¹H-MRS即可鉴别出常规MRI检查无异常而却存在脑损伤的患儿^[9-11]。本研究结果显示，对照组与HIE各组的NAA/Cr、Lac/Cr值比较差异有统计学意义，且轻、中、重度HIE患儿各组间的NAA/Cr、Lac/Cr值比较差异有统计学意义。HIE越重，NAA/Cr值越低，而Lac/Cr值越高，提示NAA与患儿的脑损伤程度呈负相关，Lac与患儿的脑损伤程度呈正相关。因此，脑灰质的乳酸/乙酰天门冬氨酸(Lac/NAA)含量是最为准确的预测新生儿脑病远期神经发育预后的定量标志。Lac/NAA对早期临床管理决策及远期神经发育预后的评估具有重要的价值^[12]。

本研究还表明，在不同程度HIE中，Caspase-3与NAA、Cho、Lac、Cr无明显相关性。在轻度HIE中，NAA/Cr、Lac/Cr值高于对照组，而血清Caspase-3水平与对照组无显著差异，说明NAA、Lac反映病情变化更加敏感，可作为早期诊断指标。Caspase-3水平随着病程进展而变化显著，且临床上检测Caspase-3相对容易，因此Caspase-3可作为HIE病程监测的重要指标。

本研究未观察Caspase-3恢复正常的时间，也未对研究对象行MRS的动态观察，需进一步的大样本、长时间的研究来进一步明确Caspase-3和MRS在HIE中的作用。总之，血清Caspase-3、脑代谢产物的检测各有其局限性，两者联合应用可提高预测水平，可作为早期诊断、病情判断、病程监测及预后评估的重要指标。