武汉大学学报(医学版)   2017, Vol. 38Issue (5): 740-744   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.05.012.
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引用本文 

姚曙东, 郑菲, 詹佳. 盐酸戊乙奎醚对内毒素刺激的肺微血管内皮细胞的作用及对β-抑制蛋白-2的影响[J]. 武汉大学学报(医学版), 2017, 38(5): 740-744. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.05.012.
YAO Shudong, ZHENG Fei, ZHAN Jia. Effect of Penehyclidine Hydrochloride on Endothelial Injury and Expression of Beta-Arrestin-2 in LPS-Induced HPMVEC[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2017, 38(5): 740-744. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.05.012.

作者简介

姚曙东，男，1976-，医学硕士，主治医师，主要从事围术期脏器保护研究

基金项目

武汉市科技局晨光计划(编号：2016070204010150)

通讯作者

詹佳，女，1981-，医学博士，副主任医师，主要从事围术期脏器保护研究

文章历史

收稿日期：2016-11-01
Contents              Abstract             Full text              Figures/Tables              PDF
盐酸戊乙奎醚对内毒素刺激的肺微血管内皮细胞的作用及对β-抑制蛋白-2的影响
姚曙东 1, 郑菲 2, 詹佳 2     
1. 鄂东医疗集团黄石市中心医院麻醉科 湖北 黄石 435000;
2. 武汉大学中南医院麻醉科 湖北 武汉 430071
收稿日期：2016-11-01
基金项目：武汉市科技局晨光计划(编号：2016070204010150)
作者简介：姚曙东，男，1976-，医学硕士，主治医师，主要从事围术期脏器保护研究
通讯作者：詹佳，女，1981-，医学博士，副主任医师，主要从事围术期脏器保护研究
[摘要] 目的: 探讨在内毒素(LPS)作用下盐酸戊乙奎醚(PHCD)对肺微血管内皮细胞的作用及β-抑制蛋白-2(β-arrestin-2) 表达的影响。方法: 培养人肺微血管内皮细胞，用随机数字表法将其分为4组：正常对照组(C组)、LPS诱导组(L组)、PHCD+LPS组(PL组)及PHCD对照组(P组)。P组和PL组加入终浓度为2 μg/ml的PHCD，L组及PL组加入终浓度为0.1 μg/ml的LPS，PL组于加入PHCD后60 min再加入LPS，C组加入同等体积的培养基。加入LPS 60 min后，测细胞LDH水平、VCAM-1、VE-cadherin表达及β-arrestin-2的表达。结果: 与C组比较，L组细胞LDH水平、VCAM-1表达升高，VE-cadherin和β-arrestin-2表达降低；与L组比较，PL组细胞LDH水平、VCAM-1表达降低，而VE-cadherin和β-arrestin-2表达增加。结论: 盐酸戊乙奎醚预处理，可以通过上调β-arrestin-2的表达，减轻LPS引起的肺微血管内皮细胞损伤。
关键词：盐酸戊乙奎醚    人肺微血管内皮细胞    血管内皮细胞黏附分子-1    血管内皮钙黏蛋白    β-抑制蛋白-2    内毒素    
Effect of Penehyclidine Hydrochloride on Endothelial Injury and Expression of Beta-Arrestin-2 in LPS-Induced HPMVEC
YAO Shudong1, ZHENG Fei2, ZHAN Jia2     
1. Dept. of Anesthesiology, Huangshi Central Hospital of Edong Healthcare, Hubei Polytechnic University, Huangshi 435000, Hubei, China;
2. Dept. of Anesthesiology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China
[Abstract] Objective: To investigate the effect of penehyclidine hydrochloride (PHCD) on endothelial injury and expression of β-arrestin-2 in lipopolysaccharide (LPS)-induced human pulmonary microvascular endothelial cell (HPMVEC). Methods: HPMVEC were cultured and seeded in 6-well plates (2 ml/hole) with the density of 2×105/ml or in culture flasks (4 ml/flask) with the density of 1×107/ml, then, cells were randomly divided into 4 groups: group control (group C), group LPS (group L), group PHCD+LPS (group PL) and group PHCD (group P). The cells were treated with 2 μg/ml PHCD in group P. In group PL, cells were treated with 2 μg/ml PHCD for 60 min and then stimulated with 0.1 μg/ml LPS. Cells in group C were cultured with the same amount of medium. Then, cells were collected at 60 min after LPS treatment to measure the level of LDH, and the expression of VCAM-1, VE-cadherin and β-arrestin-2. Results: Compared with group C, the level of LDH and expression of VCAM-1 were increased, and the expression of VE-cadherin and β-arrestin-2 were decreased in group L. Compared with group L, the level of LDH and expression of VCAM-1 were decreased, and VE-cadherin and β-arrestin-2 expression were increased in group PL. Conclusion: These findings suggest that PHCD can alleviate the LPS-induced pulmonary microvascular endothelial injury by increasing the expression of β-arrestin-2.
Key words: Penehyclidine hydrochloride    HPMVEC    VCAM-1    VE-Cadherin    β-Arrestin-2    Lipopolyaccharide    

脓毒症是感染相关的全身炎性反应综合征，肺脏常为脓毒症所致的多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)中最早发生衰竭的器官之一，主要表现为急性肺损伤(acute lung injury, ALI)[1, 2]。内毒素(lipopolysaccharide, LPS)作为脓毒症主要致病因子，可通过直接和间接作用损伤肺微血管内皮细胞，使肺微血管通透性增高，发生炎症及水肿，引起ALI[3]。盐酸戊乙奎醚(penehyclidine hydrochloride, PHCD)是一种新型莨菪类抗胆碱能药物，由于其具有改善动脉血氧分压，抑制炎性介质产生的作用，近年来临床上常用其治疗急性肺损伤[4]。已有研究表明，盐酸戊乙奎醚对LPS诱导的内皮细胞损伤有保护作用[5]。β-抑制蛋白(β-arrestins)是一种调控蛋白，有研究表明，β-arrestins基因敲除小鼠比野生小鼠ALI发生率高，提示β-arrestins在ALI中具有重要作用[6]。本研究利用LPS与细胞共同孵育建立体外脓毒症模型，观察盐酸戊乙奎醚对内皮细胞乳酸脱氢酶(LDH)水平，血管内皮细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1)，血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)及β-抑制蛋白-2(β-arrestin-2) 表达的影响。

1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器

长托宁注射液(成都力思特制药厂，批号：20130418)，LPS(美国Sigma公司，Escherichia coli 0111：B4)，细胞株(美国ScienCell研究实验室)，培养基(美国Sigma公司)；LDH试剂盒(南京建成生物工程研究所)；免疫细胞化学试剂盒DAB显色剂(丹麦DAKO公司)；Western Blot中β-arrestin-2一抗(英国Abcam公司)，β-actin一抗(美国Santa Cruz公司)，二抗(美国KPL公司，山羊抗兔)，SDS-PAGE凝胶制备调剂盒(武汉谷歌生物科技有限公司)；免疫细胞化学中VCAM-1一抗(北京博奥森生物科技有限公司)和抗VE-cadherin一抗(美国Santa Cruz公司)，二抗(丹麦DAKO公司)；实时定量PCR所用试剂均购自武汉谷歌生物科技有限公司。紫外分光光度计(上海现科仪器有限公司，752-P)，电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-6C)，倒置显微镜(日本Nikon公司，ECLIPSE TI-SR)，CO2恒温细胞培养箱(日本SANYO公司，MCO-15AC孵育箱)。

1.2 人肺微血管内皮细胞培养

人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cell，HPMVEC)购自美国ScienCell研究实验室。用加入青/链霉素双抗的10%胎牛血清RPMI 1640培养基，置于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养，隔天换液，相差显微镜下观察，培养瓶中单个细胞呈梭形或多边形，细胞株不断生长、分化后，融合呈典型铺路石样排列。待细胞培养至80%左右融合时，吸弃培养液，用PBS冲洗2次。用37 ℃预温的0.25%胰蛋白酶消化2-3 min，加3 ml培养基终止消化，吹打混匀成悬液，计数后按1:2比例传代。实验取4-6代细胞。

1.3 细胞接种

将进行LDH水平检测和免疫细胞化学分析的细胞接种至6孔板上，接种前用1 ml培养液润湿6孔板，之后将细胞混悬液以2×105个/孔的细胞数接种，放入培养箱培养24 h后细胞融合成致密单层，可用于实验。

1.4 分组及处理

将培养瓶或培养板内的细胞，采用随机数字表法分为4组，正常对照组(C组)、LPS诱导组(L组)、PHCD+LPS组(PL组)和PHCD对照组(P组)。C组加入等容量培养基；P组和PL组加入终浓度为2 μg/ml的PHCD，L组及PL组加入终浓度为0.1 μg/ml的LPS，PL组于加入PHCD后60 min加入LPS。处理后的细胞放入细胞培养箱中培养60 min。

1.5 测定细胞LDH水平

取出加入处理因素后培养60 min的6孔板，每组取两板，任选10个培养孔，按照LDH试剂盒说明书进行操作，用2, 4-二硝基苯肼显色法检测LDH水平。

1.6 免疫细胞化学法测定细胞VCAM-1及VE-cadherin的表达

取出加入处理因素后培养60 min的6孔板，放置灭菌盖玻片，以4%多聚甲醛固定，冲洗甩干后用组化笔于盖玻片中间细胞分布均匀处画圈，圈内滴加3% BSA封闭(美国Sigma公司)，除去BSA后滴加抗VCAM-1一抗和抗VE-cadherin一抗，4 ℃孵育过夜。次日取出后洗涤甩干，在圈内滴加二抗室温孵育50 min，圈内滴加DAB显色液，显色成功后苏木素复染，脱水透明干燥封片。采用Image Pro Plus 6.0全自动图像分析系统对阳性染色进行分析，随机选取5个高倍视野，测定阳性表达的吸光度值，取平均值反映VCAM-1和VE-cadherin的表达。

1.7 Western Blot分析β-arrestin-2的表达

每组取5个培养瓶，在加入LPS 60 min后收集细胞，检测β-arrestin-2的表达。采用蛋白抽提试剂提取总蛋白，计算后取40 μg总蛋白以浓缩胶电压75 V、分离胶电压120 V进行SDS-PAGE电泳，至溴酚蓝跑出即可终止电泳。随后分离的总蛋白以200 mA、1 h的条件转印至PVDF膜，用5%脱脂奶粉溶于0.5%TBST配成封闭液，膜置于封闭液中室温作用1 h以封阻非特异性结合。加入β-arrestin-2一抗和抗β-actin一抗，4 ℃孵育过夜，TBST漂洗滤膜3次，每次5 min，加入二抗，室温下平缓摇动孵育1 h，再次漂洗滤膜后，进行增强化学发光反应。采用AlphaEase FC软件进行光密度扫描分析显影带。以目的条带光密度值与β-actin光密度值的比值表示人肺微血管内皮细胞β-arrestin-2蛋白的表达。

1.8 实时荧光定量PCR检测β-arrestin-2 mRNA的表达

取培养60 min的细胞，采用Trizol提取总RNA，逆转录合成cDNA，然后进行PCR。用引物设计软件设计出β-arrestin-2上游引物：CTGTAGATGGCGTGGTGCTTGTG，下游引物：TGGTAGGTGGCGATGAACAGGT，扩增片段长度148 bp。内参β-actin上游引物：GTCCACCGCAAATGCTTCTA，下游引物：TGCTGTCACCTTCACCGTTC，扩增片段长度190 bp。PCR反应体系：2×qPCR Mix 12.5 μl，2.5 μmol/L内标引物2.0 μl，反转录产物2.0 μl，ddH2O 8.5 μl。反应条件：95 ℃预变性1 min，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共进行40个循环，此后再72 ℃延伸5 min。PCR完成后，采用ABI Prism SDS 2.0软件进行分析，导出相应的循环阈值，采用2-△△CT值作为目的基因的相对表达量。

1.9 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，各组方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett T3检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与C组比较，L组细胞LDH水平、VCAM-1表达升高，VE-cadherin和β-arrestin-2表达降低(P＜0.01)，而P组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05)；与L组比较，PL组细胞LDH水平(P＜0.01)、VCAM-1表达(P＜0.05) 降低，而VE-cadherin和β-arrestin-2表达增加(P＜0.01)。结果见表 1。

表 1 四组细胞LDH水平、VCAM-1、VE-cadherin和β-arrestin-2表达的比较(x±s)
3 讨论

脓毒症是重症患者中常见危重症，具有发病率高、病死率高的特点[7]。ALI为脓毒症发展过程中较早出现的并发症，其主要病理生理基础之一是肺微血管通透性增高，在通透性增高过程中，内皮细胞损伤起着关键作用[6]。LPS作为脓毒症的主要致病因子，可通过直接和间接作用损伤肺微血管内皮细胞。HPMVEC不但是构成微血管通透性的主要物理屏障，还具有分泌功能，当其损伤时可能发生多种病理过程。

一般正常情况下LDH存在于细胞内，但细胞受损或坏死时，细胞膜完整性破坏，LDH溢出至细胞外，因此通过检测LDH水平可反映细胞受损程度。本研究结果表明，LPS刺激后LDH水平升高，提示细胞膜完整性被破坏，LPS可引起细胞损伤。而预先使用PHCD处理的细胞和未用PHCD处理的细胞相比，LDH水平降低，提示盐酸戊乙奎醚可减轻肺微血管内皮细胞损伤。

VCAM-1是免疫球蛋白超家族成员，一般正常状态下在内皮细胞中基本无表达，但在炎症因子或内毒素的诱导下表达增加。ALI重要过程之一是中性粒细胞与内皮细胞黏附，有研究表明VCAM-1参与调节炎症反应和内皮细胞完整性，介导中性粒细胞与内皮细胞的黏附激活[8]，是ALI中肺微血管内皮细胞损伤发生发展的分子标志。VE-cadherin是一特异性表达于内皮细胞表面的钙黏附素家族成员，是内皮细胞黏附连接的主要黏附蛋白，对维持正常血管内皮细胞完整性必不可少[9]。刺激因子作用于血管内皮时，VE-cadherin酪氨酸磷酸化、断裂及内化，造成内皮细胞间连接的分解。有研究表明LPS通过下调VE-cadherin的表达及改变其功能状态和分布，使血管通透性增加[10]。微血管通透性升高进一步使炎症介质大量聚集，释放蛋白酶及氧自由基等直接造成组织和细胞的损伤。本研究中，预先给予盐酸戊乙奎醚后，VCAM-1表达降低，VE-cadherin表达升高，同时LDH水平减少，提示盐酸戊乙奎醚预处理可以通过调节VCAM-1和VE-cadherin的表达从而减轻内皮细胞损伤。

β-arrestins主要包括β-arrestin-1和β-arrestin-2，全身广泛性表达并参与对大部分G蛋白偶联受体(GPCRs)信号的负向调控[11, 12]。近年来研究显示其还参与MAPK信号通路等许多非G蛋白偶联受体激活的信号传导。它可通过结合胞质内一些小分子蛋白，将G蛋白受体信号通路和其他通路相联系[13]。有研究报道，β-arrestins可以负向调节内毒素休克时的信号传导通路，最终通过抑制NF-κB的活化抑制炎症因子的产生，减轻组织细胞损伤。本实验中，预先给予盐酸戊乙奎醚的肺微血管内皮细胞β-arrestin-2表达升高，提示盐酸戊乙奎醚减轻内皮细胞损伤的作用可能与上调β-arrestin-2表达有关，其具体作用可能与β-arrestin-2抑制NF-κB信号的激活有关。另有关于山莨菪碱抗休克作用机制的研究表明，山莨菪碱可通过上调β-arrestins的表达抑制NF-κB信号的活化，参与抗休克作用，机制可能与cAMP依赖的蛋白激酶A信号通路有关[14]。同为M受体拮抗剂的盐酸戊乙奎醚也有可增加β-arrestin-2表达的作用，其机制可能也与细胞内cAMP水平增加有关。

综上所述，盐酸戊乙奎醚预处理，可以减轻LPS诱导的人肺微血管内皮细胞损伤，其作用机制与上调β-arrestin-2的表达有关。

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