心房颤动(房颤)是临床上常见的心律失常，国内研究显示我国房颤总患病率为0.77%^[1]，且房颤的发病率呈增长趋势^[2]。房颤是严重危害人类健康的疾病之一，流行病学调查结果表明房颤患者的脑卒中发生率和死亡率明显升高，以持续性房颤和永久性房颤的危害性为最重。临床上治疗房颤的主要手段为药物和导管消融治疗，但药物治疗房颤的远期效果差，且长期应用毒副作用大；房颤导管消融虽可使部分患者得到有效治疗，但随访发现其远期成功率低，复发率高^[3]。有研究发现大多数房颤患者均呈阵发性房颤进展为持续性房颤再到永久性房颤这一过程^[4]。故明确房颤的发生发展机制，探寻有效阻止房颤发生发展的手段意义重大。

参松养心胶囊是我国自主研制的治疗心律失常的中成药，近年来，人们发现参松养心胶囊对房颤有明显的抑制作用，且安全性好^[5]。但参松养心对阵发性房颤的进展有无抑制作用，其具体作用机制如何目前还不清楚。本研究通过制备阵发性房颤模型，研究参松养心胶囊对阵发性房颤心房肌基质重构及房颤进展的影响，探讨其作用机制。

犬肿瘤坏死因子α (TNF-α)抗体购买于Abcam公司，犬白细胞介素6 (IL-6) 抗体购买于LSbio公司，α7烟碱型乙酰胆碱受体(a7nAChR)抗体购买于Abcam公司；犬TNF-α和IL-6酶联免疫试剂盒购买于Elabscience公司，犬乙酰胆碱(Ach)测试盒购买于南京建成生物工程研究所。兔多克隆抗TH抗体及ChAT抗体购买于LSbio公司，二抗HRP标记兔抗山羊购买于ASPEN公司；参松养心粉剂由石家庄以岭药业股份有限公司提供(包含12味药：人参、麦冬、山茱萸、丹参，酸枣仁(炒)、桑寄生、赤芍、土鳖虫、甘松、黄连、南五味子、龙骨)。

18只成年杂种犬，平均体重(18.2±0.9) kg，雌雄不拘，戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉(根据动物反应每30-60 min静脉追加戊巴比妥钠50 mg)，气管插管，机械通气(MAO01746, USA)，采用体表Ⅱ、Ⅲ导联监测心电图。随机将实验动物分为对照组、起搏组、参松组。对照组(n=6) 植入起搏器后程控关闭起搏器；起搏组(n=6) 植入起搏器后长期间断起搏右心房，每日(400次/min)起搏8 h，共8周；参松组植入起搏器后长期间断起搏右心房同起搏组，同时每天喂养参松养心0.2 g/kg原药粉8周；所有犬起搏器植入方法同前^[6]。

所有犬均在喂养8周后再次麻醉，后平卧位固定于实验台。左右第4肋间开胸，充分暴露心脏，用6F多极电极对左右心房、左右心耳外膜分别进行心房有效不应期(AERP)监测(四川锦江，LEAD-2000B)，AERP和房颤诱发方法同前^[7]。

所有实验动物在试验基线期和终点分别取静脉血2 ml，标本放入试管中，低温下(4 ℃)3 000 g离心10 min，吸取上清液，放入冷冻管-80 ℃贮存待测。实验终点处死动物后，快速取出心脏，用冷生理盐水(在冰上操作)洗净后，分离出右心房组织，－80 ℃保存待测。血清和心房肌组织的TNF-α、IL-6和Ach指标均采ELISA方法检测。

右心房组织的TNF-α、IL-6和a7nAChR蛋白表达采用Western Blot方法检测。采用BCA法测量蛋白浓度，将组织裂解产物使用SDS-PAGE胶进行分离，然后转移到PVDF膜上，再使用5%脱脂牛奶封闭2 h。孵育一抗4 ℃过夜。37 ℃孵育二抗1 h。将胶片结果进行扫描存档，用AlphaEase FFC凝胶图像分析软件分析目标带的光密度值。

右心房组织酪氨酸羟化酶(TH)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)等神经密度水平采用免疫荧光法检测。将包埋好组织的石蜡切片脱水后PBS洗3次，去除BSA液后，将一抗兔单克隆抗TH抗体和兔多克隆抗ChAT抗体加入后4 ℃过夜，PBS洗后在组织上滴加适量的抗荧光淬灭剂，盖玻片封片，对阳性表达区域进行半定量分析，每只动物采用盲法随机选取2张切片，每个切片随机取5个高倍镜测得结果后取均值。应用计算机辅助图像分析系Image-Pro Plus 6.0计算神经密度，以神经纤维面积与总检测面积比值表示(mm²/m²)，每组心房的神经密度结果为右心房平均的神经密度水平。TH阳性表示交感神经分布，ChAT阳性代表生长的迷走神经纤维。

实验数据用均数±标准差表示，采用SPSS 17.0统计软件分析，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组内比较采用配对样本t检验统计结果；免疫组织化学结果定量分析采用秩和检验，双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

与对照组相比，起搏组和参松组犬心房各部位的AERP明显降低，但参松组犬的AERP明显高于起搏组(表 1)。起搏组犬的AERP离散度明显高于对照组和参松组[(13.8±1.9) ms vs (8.3±0.8) ms; (13.8±1.9) ms vs (7.7±1.9) ms; P＜0.01]，参松组犬的AERP离散度与对照组无差别。起搏组犬的房颤诱发时间和次数均明显高于对照组和参松组，参松组犬的房颤诱发时间和次数也大于对照组(表 2)。

表 1(Table 1)

表 1 三组犬不同部位AERP的比较(x±s, ms) 部位 对照组 起搏组 参松组 左心房 122±4 104±6* 113±4*# 右心房 121±4 105±5* 112±4*# 左心耳 124±5 107±7* 114±5*# 右心耳 123±5 105±6* 115±5*# 与对照组比较，*P＜0.05；与起搏组比较，# P＜0.05

表 1 三组犬不同部位AERP的比较(x±s, ms)

表 2(Table 2)

表 2 三组犬房颤诱发的比较 组别 房颤诱发次数 房颤诱发时间(s) 对照组 1.2±0.4 11.2±4.8 起搏组 3.8±0.8* 71.2±12.5* 参松组 2.0±0.6*# 28.3±9.2*# 与对照组比较，*P＜0.05；与起搏组比较，# P＜0.05

表 2 三组犬房颤诱发的比较

与基线期相比，对照组犬8周后血清的TNF-α、IL-6和Ach水平无明显变化。起搏组和参松组犬血清TNF-α和IL-6水平明显升高，Ach水平明显下降，但起搏组犬TNF-α和IL-6水平升高和Ach水平下降更明显。8周后，起搏犬血清的TNF-α和IL-6水平明显高于参松组，Ach水平明显低于参松组(表 3)。

表 3(Table 3)

表 3 血清炎性因子和Ach水平在基线和8周后三组中的比较 组别及时间 Ach(μg/ml) TNF-α(pg/ml) IL-6(pg/ml) 对照组  基线 65.0±9.8 99.0±18.3 194.0±21.0  8周后 66.0±8.2 101.0±17.5 197.0±34.6 起搏组  基线 64.0±10.7 97.0±13.8 200.0±30.6  8周后 23.0±4.1* 302.0±39.4* 607.0±54.6* 参松组  基线 67.0±10.4 97.0±13.8 199.0±37.8  8周后 43.0±5.8*† 219.0±35.8*† 397.0±47.6*† 与对照组比较，*P＜0.05；与起搏组比较，†P＜0.05

表 3 血清炎性因子和Ach水平在基线和8周后三组中的比较

炎性因子和a7nAChR蛋白的表达结果如图 1所示：与对照组相比，起搏组和参松组的TNF-α和IL-6水平明显升高，a7nAChR蛋白表达明显降低；与起搏组相比，参松组的TNF-α和IL-6水平明显降低，a7nAChR蛋白表达明显升高。

图 1(Figure 1)

图 1 右心房炎性因子和α7nAchR蛋白表达的Western Blot结果 与对照组比较，*P＜0.05；与起搏组比较，#P＜0.05

3组间心房TH神经密度的免疫荧光结果见图 2。起搏组和参松组的TH均较对照组明显增加[3 076±515) vs (1 343±319) μm²/mm²；(2 337±337) vs (1 343±319) μm²/mm²；P＜0.05]；与起搏组相比，参松组的TH表达显著减少[(3 076±515) vs (2 337±337)；P＜0.05]；三组间ChAT的表达无明显差异(P＜0.05)。

图 2(Figure 2)

图 2 右心房TH和ChAT神经密度分布的免疫荧光化学结果(×400) A：对照组TH免疫荧光；B：起搏组TH免疫荧光；C：参松组TH免疫荧光；D：对照组ChAT免疫荧光；E：起搏组ChAT免疫荧光；F：参松组ChAT免疫荧光；红色代表TH和ChAT阳性神经，蓝色代表心肌细胞核；与对照组比较，**P＜0.05；与起搏组比较，##P＜0.05

房颤是临床上常见的心动过速，约占所有住院心律失常患者的1/3。随着人口老龄化，房颤的流行水平呈增长趋势。房颤不但影响患者的生活质量，且是中风和外周血管栓塞的重要原因。药物仍是目前治疗房颤的主要手段，但研究显示当前药物治疗房颤维持窦性心律的几率低，且抗心律失常药物副作用大，患者依从性差。

近年来，人们发现参松养心胶囊对房颤有明显的抑制作用，且安全性好^[5]。参松养心胶囊是我国自主研制的治疗心律失常的中成药，它由十二味中药组成。针对心律失常的中医病理机制，参松养心胶囊温清并用，通补兼施，既补络中气阴又通络脉瘀滞，还清心经虚火，使心络之气阴充盛，脉络通利，心神安宁，体现了对本病多环节发病机制的整合调节作用^[8]。但口服参松养心对阵发性房颤的进展及其具体机制目前还不清楚。本研究通过制备阵发性房颤模型犬，研究参松养心对阵发性房颤心房肌基质重构及房颤进展的影响。我们发现参松养心不仅明显抑制阵发性房颤的诱发，且明显抑制长期间断心房起搏导致的血清及心房肌炎性因子升高和交感神经增生，我们还发现长期间断心房起搏可明显降低血清Ach水平和心房肌a7nAChR蛋白表达。结果提示参松养心抑制房颤的诱发可能与其调节胆碱能抗炎通路相关。

研究已证实迷走神经末梢释放的Ach与α7nAChR结合，激活α7nAChR后可抑制TNF-α、IL-6等多种炎性因子的释放，从而对多种炎症反应性疾病具有保护作用，此作用机制称为胆碱能抗炎通路。业已证实炎性因子可导致心房肌电重构和纤维化，促进房颤的发生发展^[9]。TNF-α通过TNF-α受体促进基质金属蛋白酶的表达与分泌，刺激心肌细胞凋亡及心肌间质纤维化，引起心肌结构重构；IL-6作为炎性反应的中枢调节者，可促进心肌细胞表达细胞间黏附因子并激活基质金属蛋白酶，诱导心肌细胞的坏死、凋亡，引起心肌纤维化。本研究结果提示，长期口服参松养心抑制阵发性房颤发生的机制与其影响胆碱能抗炎通路有关，通过抑制长期间断心房起搏导致a7nAChR蛋白表达的下降，从而抑制血清和心房肌炎性因子的升高，进而抑制心房肌电重构和基质重构。本研究不仅进一步揭示了参松养心抑制阵发性房颤发生的机制，且为药物治疗房颤提供新的思路和方向。