在体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)的历史进程中，人们一直在寻找一种能够评估胚胎发育潜能的方法，根据胚胎形态学标准选择优质胚胎也只有部分胚胎能发育至足月分娩，并非所有形态学评分优良的胚胎都具有良好的发育能力。而植入前胚胎遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)在人类辅助生殖技术中用于挑选无遗传缺陷的胚胎移植，具有重要的临床意义，但受制于其检测的侵入性及费用昂贵，临床工作中并未广泛应用。因此需要更加简单易行的、无创的评估胚胎发育潜能方法，选择最具种植潜力的胚胎以提高胚胎移植临床妊娠率。低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein, LRP)-1是一种细胞表面蛋白，相对分子质量约6×10⁵，广泛表达于各种组织^[1]。除了细胞表面的LRP-1外，在人血浆、脑脊液等体液中也发现有LRP-1的表达^{[2, 3]}。国外有文献报道在鼠胚体外培养液中检测到LRP-1表达^[4]，小鼠LRP基因敲除可使胚胎致死，与胚胎生长发育和着床密切相关^[5]。本研究旨在检测人胚胎培养液中是否有LRP-1的表达，并进一步探讨LRP-1的表达量与胚胎发育潜能和妊娠率的关系。

本研究选取2015年3月-2016月10月期间在武汉大学中南医院生殖中心行IVF-ET的患者共55人，患者年龄23-35岁，平均年龄(30.69±3.73) 岁，不孕年限(3.14±2.29) 年，不孕原因为单纯输卵管因素或男性因素，经阴道超声检查盆腔内未见异常，无泌尿生殖系统感染性疾病，IVF-ET前常规检查未见异常。

均采用标准长方案控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH), 于IVF-ET前一个月经周期的黄体中期(月经稀发或不规律者行人工周期)给予达必佳(注射用醋酸曲普瑞林，德国辉凌制药有限公司)进行垂体降调节。月经周期第3-5天检查达到垂体降调节标准[黄体生成素(LH)≤5 IU/L，雌二醇(E₂)＜50 pg/ml，双侧卵泡最大直径＜10 mm，子宫内膜厚度≤5 mm)]后开始注射rFSH(果纳芬，瑞士默克雪兰诺有限公司)或HMG(丽珠药业)，根据卵泡生长速度和卵巢反应等情况调整用药，阴道超声检查当有50%目标卵泡直径≥18 mm时，当天晚上肌注人绒毛膜促性腺激素(HCG) 6 000-10 000 IU，注射后36 h后行经阴道超声引导取卵术。取卵日开始黄体支持。取卵后行体外受精，受精后选择形态学评分高的2个胚胎进行移植，其余胚胎根据具体情况继续培养或冷冻保存；若不适合移植则冷冻或继续培养，后续进行解冻移植。于胚胎移植后14 d查血HCG，若HCG阳性则继续黄体支持，2周后经阴道超声检查，有原始心管搏动为临床妊娠。

按peter卵裂期胚胎评分系统进行胚胎评分^[6]。Ⅰ级：胚胎卵裂球均匀、规则、有中等折光性，透明带完整，胞质均匀清晰没有颗粒现象，碎片少于10%；Ⅱ级：卵裂球形态轻度不规则，稍不均匀，卵裂球之间大小相差小于30%，折光度有轻微变化，碎片少于30%；Ⅲ级：胚胎内碎片少于50%，碎片外卵裂球形态同Ⅱ级，具有一定折光性，透明带完整；或碎片少，但卵裂球形态明显不均匀，卵裂球之间大小相差在30%-50%之间；Ⅳ级：胚胎内碎片大于50%，碎片外卵裂球具有生存活力；或碎片少，但卵裂球形态严重不均匀，卵裂球之间大小相差在50%以上。优质胚胎为形态学评分为Ⅰ级或Ⅱ级的胚胎。

IVF受精后观察受精情况，受精卵移入G1(Vitrolife)盖油培养滴中，放置于37 ℃、6%CO₂、95%湿度的培养箱，受精16-19 h观察原核，第2天和第3天观察卵裂情况并进行胚胎形态学评分，挑选评分Ⅰ级或Ⅱ级的胚胎进行胚胎移植。将相同形态学级别的移植或冷冻胚胎培养液约30 μl共同收集于EP管中，同一培养条件的未放置胚胎的培养液20份用于对照，储存在-20 ℃, 待测。

采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定收集样本中的LRP-1水平，所有操作按照LRP-1 ELISA试剂盒说明书进行，最终实验结果以酶标仪读数为准。往包被好的酶标板微孔中加入倍比稀释的标准品、待测样本，37 ℃温育2 h。甩干后加入生物素标记抗体，37 ℃温育1 h，洗板3次。加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，37 ℃温育1 h，洗板5次。加入底物溶液显色，终止液终止反应，用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的光密度值(OD值)。根据标准品浓度及对应OD值绘制线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度。LRP-1 ELISA试剂盒由武汉基因美公司提供，酶标仪为芬兰(Labsystems Multiskan MS)公司产品，移液器为吉尔森P型移液器(Pipetman)。

采用SPSS 22.0统计软件分析和处理数据, 各项数据测定结果用均数±标准差(x±s)表示, 计量资料两组之间比较采用t检验, P < 0.05时认为差异有统计学意义。

按胚胎级别分为优质胚胎培养液150份，Ⅲ级胚胎培养液48份。优质胚胎对应的培养液中LRP-1的表达水平高于Ⅲ级胚胎的表达水平，两者比较差异有统计学意义(P＜0.05，见表 1)。所收集的20份未放置胚胎的培养液中均未检测到LRP-1的表达。

表 1(Table 1)

表 1 第3天胚胎培养液中LRP-1水平与胚胎评分的关系 胚胎分级 例数 LRP-1(pg/ml) 优质(Ⅰ级+Ⅱ级) 150 991.79±182.60 Ⅲ级 48 639.22±108.09 空白对照 20 0

表 1 第3天胚胎培养液中LRP-1水平与胚胎评分的关系

进行胚胎移植患者34例，均移植2个胚胎，根据妊娠结局分为妊娠组和未妊娠组，妊娠组21例，未妊娠组13例。两组患者的年龄、不孕年限、基础FSH、Gn用药天数、获卵数、受精数、卵裂率均无统计学差异(P＞0.05)，组间有可比性，见表 2。妊娠组胚胎培养液中LRP-1的表达水平(1 056.34±166.82 pg/ml)高于未妊娠组的表达水平(899.46±169.37 pg/ml)，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

表 2(Table 2)

表 2 妊娠组和未妊娠组一般临床资料的比较 项目 妊娠组(n=21) 未妊娠组(n=13) P 年龄(年) 29.90±4.04 29.92±3.73 0.990 不孕年限(年) 2.83±1.85 4.42±2.98 0.063 基础FSH(mIu/ml) 7.45±1.55 7.06±2.12 0.540 Gn天数(d) 10.43±0.60 10.46±1.45 0.939 获卵数 17.67±6.90 14.84±4.02 0.191 受精数 15.00±6.50 11.62±4.59 0.112 卵裂数 14.90±6.48 11.54±4.63 0.113 LRP-1(pg/ml) 1 056.34±166.82 899.46±169.37 0.012

表 2 妊娠组和未妊娠组一般临床资料的比较

目前，辅助生殖技术的发展仍面临一系列问题，其中胚胎质量是影响临床妊娠的关键因素，如何评判胚胎质量，挑选具有发展潜能的胚胎进行移植是临床工作中面临的重要问题。现在广泛应用的胚胎形态学评分标准存在很多的局限性，并非所有的形态学指标提示优良的胚胎都具有正常生长发育的能力。因此建立相对完善的胚胎学评价标准对于预测胚胎的发育潜能及提高临床妊娠率有重要意义。

随着分子生物学技术的快速发展与应用，与胚胎早期发育相关的细胞因子相继被发现，其分泌量能够客观地反映胚胎的代谢情况，能否利用胚胎代谢产物中胚胎内源性因子来评估胚胎发育潜能成为研究的热点。本研究发现优质胚胎对应胚胎培养液中LRP-1的表达水平明显高于Ⅲ级胚胎，表明LRP-1的表达水平与胚胎形态学分级有关。可能与优质胚胎和Ⅲ级胚胎在显微镜下碎片数目不同、细胞分裂不均有关，而碎片较多的胚胎代谢率低、发育潜能较差，因此表达较低的LRP-1水平，代谢较为活跃的胚胎分泌较多LRP-1至培养液中。对于相同形态学级别的胚胎，可通过测定其培养液中LRP-1的含量来选择胚胎进行移植。

Herz等发现破坏小鼠的LRP基因会阻碍小鼠胚胎的着床和继续发育，LRP通过调节纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1) 对其着床产生影响，证实LRP的正常表达为胚胎着床所必需^[5]。Coukos等发现在胚胎着床位置侵入的滋养层细胞有LRP表达，包括细胞滋养细胞和合体滋养细胞，体外培养的滋养层细胞也有LRP及其编码mRNA的表达，认为LRP可能在胚胎着床时滋养层细胞的侵袭过程中发挥重要作用^{[7, 8]}。而囊胚滋养层细胞的正常增殖、黏附是胚胎着床植入子宫内膜的前提。本研究对比了移植患者妊娠组和未妊娠组胚胎培养液中LRP-1的表达量，结果表明妊娠组胚胎培养液中LRP-1的表达量高于未妊娠组。因此，检测胚胎培养液中LRP-1的表达可能作为预测妊娠结局的参考指标，具体作用机理有待于进一步研究。

IVF治疗中，为了提高临床妊娠率，多个国家一般采用移植2-3个胚胎。有研究数据表明多胚胎移植使多胎妊娠率升高，同时带来不可避免的母婴危害及风险^{[9, 10]}，故当今的辅助生殖领域均提倡单胚胎移植^[9]。若胚胎培养液中LRP-1的浓度能表明胚胎的发育代谢能力，联合应用LRP-1检测和胚胎形态学评分，可为选择优质胚胎提供更加客观的标准。在临床应用还有很大困难，例如需要每个胚胎单独培养、改进实验方法以提高灵敏性和特异性等。综上所述，本研究证实IVF-ET患者胚胎培养液中有LRP-1的表达，高表达量反映了良好的胚胎形态学评分及较好的妊娠结局。采用ELISA方法检测胚胎培养液中LRP-1的表达有望为筛选优质胚胎提供一种新的、有效的非侵入性途径。