武汉大学学报(医学版)   2016, Vol. 37Issue (1): 38-41   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2016.01.009.
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引用本文 

曹好好, 许美霞, 李建国, 许涛. 电针刺激足三里穴对脓毒症大鼠心脏损害的保护作用[J]. 武汉大学学报(医学版), 2016, 37(1): 38-41. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2016.01.009.
CAO Haohao, XU Meixia, LI Jianguo, XU Tao. Effect of Electro-acupuncture at Zusanli Point on the Injury of the Heart Function in Sepsis Rats[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2016, 37(1): 38-41. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2016.01.009.

作者简介

曹好好，女，1983-，医学硕士，主要从事急危重症病理生理研究

基金项目

国家自然科学基金资助项目(编号：30972852)；武汉市科技委员会基金资助项目(编号：wx12c12)

通讯作者

许涛，男，1971-，副主任医师，主要从事急危重症临床治疗及病理生理研究

文章历史

收稿日期：2014-11-12
Contents              Abstract             Full text              Figures/Tables              PDF
电针刺激足三里穴对脓毒症大鼠心脏损害的保护作用
曹好好 1, 许美霞 1, 李建国 2, 许涛 1     
1. 武汉市普爱医院重症医学科 湖北 武汉 430033;
2. 武汉大学中南医院ICU 湖北 武汉 430071
收稿日期：2014-11-12
基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：30972852)；武汉市科技委员会基金资助项目(编号：wx12c12)
作者简介：曹好好，女，1983-，医学硕士，主要从事急危重症病理生理研究
通讯作者：许涛，男，1971-，副主任医师，主要从事急危重症临床治疗及病理生理研究
[摘要] 目的: 探讨电针刺激足三里对脓毒症大鼠心脏功能的影响以及可能的机制。 方法: 40只SD成年大鼠随机分为手术对照组(SHAM)，脓毒症模型组(CLP)，脓毒症+电针足三里组(CLP+EA)，脓毒症+电针非经非穴组(CLP+SEA)，共4组(n=10)。采用盲肠结扎穿孔术(CLP)法制备大鼠脓毒症模型。CLP+EA组电针刺双侧足三里穴；CLP+SEA组采用相同频率和强度刺激非经非穴；24 h后，摘除心脏并固定于Langendorff灌流装置，置入左心导管，测定各组大鼠的左室舒张末压(LVEDP)、左心室收缩末期压力(LVSP)，左室压最大上升速率(dp/dt max)、心脏输出量(CO)和心率(HR)。最后取心脏组织用比色法测定各组大鼠心肌组织中髓过氧化物酶(MPO)活性、心肌组织中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量，同时采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠心肌组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的含量。 结果: ①模型组各组大鼠术后24 h均出现明显感染中毒症状，血培养结果和腹腔分泌物培养结果均为阳性。②CLP组和CLP+SEA组大鼠LVEDP，dp/dt max、CO和HR，均较SHAM组明显降低(P＜0.01)，CLP+EA组较之CLP组和CLP+SEA组可见明显改善(P＜0.01)。③与SHAM组相比，各组MDA、MPO的含量显著增高，以CLP组和CLP+SEA升高更为显著(P＜0.01)，CLP+EA组SOD含量更高(P＜0.01)。各组大鼠心肌组织中的TNF-α和IL-6的浓度在CLP组、CLP+SEA组和CLP+EA组较SHAM组明显升高(P＜0.05)，其中CLP组和CLP+SEA组升高更为显著(P＜0.05)。 结论: 电针刺足三里可减轻脓毒症大鼠心肌受损程度，改善血流动力学指标，起到心脏保护作用，其机制可能与抑制炎性因子TNF-α和IL-6释放，减轻过氧化损伤有关。
关键词： 脓毒血症    足三里    氧化损伤    胆碱能抗炎通路    
Effect of Electro-acupuncture at Zusanli Point on the Injury of the Heart Function in Sepsis Rats
CAO Haohao1, XU Meixia1, LI Jianguo2, XU Tao1     
1. Pu'ai Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 430033, China;
2. Dept. of Critical Medicine, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China
[Abstract] Objective: To discuss the mechanism of the effect of electro-acupuncture at Zusanli point of the function of the rat's heart with sepsis. Methods: Forty Sprague-Dawley male rats were randomly divided in 4 groups: SHAM group, CLP group, CLP+EA groups, CLP+SEA group, 10 rats in each group. The cecum ligation perforation technique (CLP) was used for preparation of rat model of sepsis. CLP + EA group were performed electroacupuncture at Zusanli point. CLP + SEA group were used electroacupuncture at the point that far from the Zusanli point. After 24 h, the hearts were quickly removed and fixed in Langendorff perfusion devices, then put them in the left cardiac catheterization, and the left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP), left ventricular end systolic pressure (LVSP), left ventricular pressure maximum rising rate (dp/dt max), cardiac output (CO) and heart rate (HR) were determined. Last, a part of the heart tissue was taken to test the level of tissue TNF-α and IL-6 in myoeardium, the activity of myeloperoxidase (MPO), level of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) in myocardium. Results: ①The result of the blood and peritoneal cavity secretions cultures in SHAM group were negative, and in other 3 groups the results were all positive. ② in CLP group and CLP+SEA group, LVEDP, LVSP, dp/dt max, CO and HR decended obviously compared with the SHAM group, and in the CLP+EA group they were improved obviously (P < 0.01) as compared with the CLP group and CLP+SEA group. ③Compared with the SHAM group, the level of MPO and MDA significantly increased in the other 3 groups, which were higher in CLP and CLP+SEA groups than in CLP+EA group (P < 0.05). The level of SOD in CLP+EA groups were higher (P < 0.05). Compared with SHAM group, the TNF-α and IL-6 concentration in myoeardium were higher in CLP and CLP+SEA group and CLP+EA group (P < 0.05), but CLP and CLP+SEA group caused a further increase than in CLP+EA group (P < 0.05). Conclusion: Electro-acupuneture Zusanli point can relieve the injury of heart in rats with sepsis through inhibiting the TNF-α and IL-6 release and alleviating peroxidation damage.
Key words: Sepsis    Zusanli    Peroxidation Damage    Cholinergic Anti-inflammatory Pathway    

在全身炎症反应过程中，心脏自然不能幸免，有研究发现约有40%的脓毒症休克患者出现了心脏功能的减退[1]。心输出量的降低常常引起组织器官灌注不足，可诱发多器官功能衰竭，增加病死率。因此找到能有效防治心脏损害的途径，是十分具有临床意义的。胆碱能抗炎通路已被证实能够抑制过度的炎性反应，对脓毒症发挥治疗作用，而刺激足三里能通过增加迷走神经传出活性而激活胆碱能抗炎通路。肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6是炎症反映中起重要作用的炎症因子，大量研究表明，TNF-α、IL-6等与心功能异常有关。此外，在脓毒血症过程中的氧化应激通过脂质过氧化以及血浆中的抗氧化物反映出来，氧化损伤或许是导致细胞损伤、器官功能失调、机体死亡的重要原因。

本研究在上述理论和实验的基础上，通过制备大鼠脓毒症模型，观察电针足三里穴对大鼠心功能参数、心肌组织中髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平、以及TNF-α和IL-6的含量变化来探讨电针足三里对脓毒症大鼠心脏功能的影响以及可能的机制。

1 材料与方法 1.1 材料

SPF级SD雄性大鼠40只，体重200-250 g，购自华中科技大学同济医学院实验动物学部。Langendorff灌流装置(同济医院急诊内科实验室)，MPO测定试剂盒、MDA测定试剂盒、SOD)试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(均购于南京建成生物工程研究所)、TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒(武汉博士德公司)。

1.2 大鼠脓毒症模型的制备和分组干预

将40只SD成年大鼠随机分4个组：①为手术对照组(SHAM)，②脓毒症模型组(CLP)，③脓毒症+电针足三里组(CLP+EA)，④脓毒症+电针非经非穴组(CLP+SEA)，n=10。采用盲肠结扎穿孔术(CLP)法制备大鼠脓毒症模型。SHAM组只开腹而不结扎盲肠。于术后1 h在清醒状态下常规消毒双下肢并备皮。CLP+EA组取双侧足三里穴(膝关节后外侧、腓骨小头下约5 mm处)直刺7 mm，后接电针仪持续针刺30 min, 强度为2 mA, 2-100 Hz; CLP+SEA组采用相同频率和强度刺激非经非穴(足三里外侧旁开0.5 cm)。

1.3 大鼠离体心脏血流动力学指标的测定

干预后的大鼠，放养24 h后，再次麻醉，静脉注射肝素(300 U/kg)后，取出心脏，固定于Langendorff装置，在肺动脉圆锥处剪一小口，使冠脉流出液自然流出。剪开左心耳，将带有小乳胶球囊的左室测压管经二尖瓣插入左心室，连结各测压管道并调零，调整Langendorff装置系统转速、流量及乳胶球囊内压力，平衡30 min，开始观察4组大鼠的左室舒张末压(LVEDP)、左心室收缩末期压力(LVSP)，左室压最大上升速率(dp/dt max)、心脏输出量(CO)和心率(HR)。

1.4 实验标本的采集与指标测定

经股静脉采血，开腹留取腹腔分泌物，送临床微生物实验室进行血培养和腹腔分泌物培养。一部分心肌组织以比色法来测定心肌组织中MPO活性、MDA和SOD含量，一部分采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠心肌中TNF-α和IL-6的含量(均严格按照试剂盒说明书操作)。

1.5 统计学方法

所有剂量资料均以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析。

2 结果 2.1 各组大鼠血培养和腹腔分泌物培养结果

SHAM组大鼠血培养和腹腔分泌物培养结果均为阴性，而手术组大鼠血培养结果和腹腔分泌物培养结果均为阳性。其中血培养结果培养出包括大肠杆菌、肠球菌、奇异变形杆菌及其他杆菌属。腹腔分泌物培养结果与血培养结果相似。

2.2 电针刺足三里对脓毒症大鼠心脏功能的影响

CLP组和CLP+SEA组大鼠的LVEDP、LVSP，dp/dt max、CO和HR均较SHAM组明显降低(P＜0.01)，前二者组间比较差异无统计学意义(P > 0.05)。CLP+EA组大鼠的LVEDP、LVSP，dp/dt max、CO和HR虽较SHAM组有所下降(P＜0.05或P＜0.01)，但与CLP组和CLP+SEA组仍可见明显改善(P＜0.01)，见表 1。

表 1 4组大鼠血流动力学参数的比较(x±s, n=10)
2.3 电针刺足三里穴对各组大鼠离体心脏组织中TNF-α和IL-6的水平的影响

除SHAM组外，大鼠心肌组织中TNF-α和IL-6的水平在CLP组、CLP+EA组和CLP+SEA组中均呈明显升高，与SHAM组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)，其中CLP组和CLP+SEA组升高更为显著，而CLP+EA组TNF-α和IL-6的水平，虽较SHAM组明显升高，但与CLP组和CLP+SEA组相比可见明显抑制(P＜0.05)，即CLP组和CLP+SEA组的TNF-α、IL-6水平升高更为显著，而CLP组和CLP+SEA组组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表 2)。

表 2 4组大鼠心脏组织TNF-α和IL-6的水平的比较(x±s, n=10)
2.4 电针刺足三里对脓毒症大鼠心脏MPO、MDA和SOD水平的影响

与SHAM组相比，模型组各组心肌组织中MPO活性与MDA含量显著增高(P＜0.01)，以CLP组和CLP+SEA升高更为显著，此二者组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。CLP+EA组MPO活性和MDA含量明显减低(P＜0.01)，同时，SOD活性在CLP组和CLP+SEA组明显减低(P＜0.01)，但在CLP+EA组活性有所增加(P＜0.01)，CLP组和CLP+SEA组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)(表 3)。

表 3 各组MPO、SOD活性与MDA含量(x±s, n=10)
3 讨论

脓毒症休克以及由此而带来的多器官功能障碍综合征(MODS)是重症病房患者常见的死亡原因。有人统计，在脓毒症患者中大约有40%-50%的患者出现了心功能减退的表现，其中约有7%的患者出现了严重的心衰。目前认为，脓毒症的心脏损害，与过度的炎症反应、大量炎性因子释放、氧化损伤、心室重构等有着密切的联系。

无论是在脓毒症早期心率代偿性增快，还是在晚期，因心脏被抑制而导致的心率减慢，都最终造成心输出量(CO)的降低。CO和LVEDP、LVSP、dp/dt max都是反映心脏泵功能的指标，它们指标的下降则表明心泵功能受损。通过监测各组大鼠离体心脏血流动力学指标，我们发现CLP组和CLP+SEA组大鼠的LVEDP、LVSP，dp/dt max、CO和HR均较SHAM组明显降低，CLP+EA组大鼠的各项指标虽较SHAM组有所下降，但与CLP组和CLP+SEA组比较可见明显改善，表明电针刺足三里穴对脓毒症大鼠心功能指标的改善有一定作用。

大量研究表明，TNF-α、IL-6等与心功能异常有关，在心血管疾病中起作用的主要是TNF-α。TNF通过促进一氧化氮(NO)释放，不但对心肌收缩产生抑制作用，而且也可以通过神经酰胺的合成和氧自由基(OFR)生成来诱导细胞凋亡。TNF可以通过破坏L型钙通道导致Ca2+内流障碍，抑制心肌的收缩功能，被认为是脓毒症时心脏收缩能力减弱的一个重要原因。IL-6可上调ICAM-1的表达，增加炎性细胞的聚集和浸润。Borovikova等[2]在研究中发现乙酰胆碱(ACh)或其他拟胆碱药，可抑制内毒素刺激引起的巨噬细胞大量释放TNF-α，此外，他们还发现ACh可抑制由内毒素刺激巨噬细胞所产生的致炎细胞因子IL-1、IL-6、IL-18的释放，但并不抑制抗炎细胞因子IL-10的释放。另有实验证实，卡巴胆碱对CLP模型大鼠促炎因子所致的心肌损伤具有明显的保护作用，能降低心肌组织对于TNF-α和NO的含量以及MPO的活性[3]，而电针刺足三里穴可增加迷走神经传出活性，进而激活胆碱能抗炎通路，抑制炎性因子的释放[4-7]，本实验中，CLP组和CLP+SEA组大鼠心肌组织TNF-α和IL-6的水平明显升高，而CLP+EA组大鼠心肌组织TNF-α和IL-6的水平明显得到抑制。因此我们推测，CLP+EA组大鼠心肌组织TNF-α和IL-6的水平得到抑制，可能正是因为电针足三里穴激活了胆碱能抗炎通路。

在脓毒血症过程中，促炎因子大量合成分泌，大量中性粒细胞和巨噬细胞激活，发生呼吸爆发，内皮细胞、心肌细胞产生OFR，进而生成大量活性氧(ROS)。ROS能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化(LPO)。细胞膜上的Ca2+泵因脂质过氧化损伤后，大量的细胞外Ca2+内流，形成钙超载，最终引起心肌收缩力下降和心功能失调。MPO活性可间接反映白细胞的浸润程度。MDA作为脂质过氧化代谢产物，其含量可间接反映出心肌细胞氧化损伤的程度，而SOD是一种具有清除氧自由基作用的保护性酶。本次实验结果显示，CLP组和CLP+SEA组大鼠心脏MPO活性和MDA含量明显升高，而CLP+EA组SOD活性较CLP组和CLP+SEA组明显升高，这不仅进一步证实脓毒症大鼠心肌损伤与炎性细胞浸润及过氧化损伤有关，同时也表明针刺足三里可减轻脓毒症时的炎性细胞浸润，抑制氧自由基释放，减轻心肌过氧化损伤。

综上所述我们可以得出这样的结论：脓毒症大鼠心肌损伤与炎性细胞浸润及过氧化损伤有关，电针刺足三里穴可抑制心脏损害，改善血流动力学指标，抑制脓毒症大鼠心脏TNF-α和IL-6的水平，抑制中性粒细胞浸润，减轻心肌过氧化损伤，其作用机制可能与电针足三里穴激活了胆碱能抗炎通路有关。

参考文献
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