孤独症谱系障碍(autistic spectrum disorder, ASD)是一组具有高度临床和病因异质性且严重影响儿童健康的神经发育障碍性疾病^[1]。ASD起病于婴幼儿期，一般3岁前发病，男性发病率为女性的4-5倍，其典型的临床症状包括刻板、重复的行为和社交障碍以及语言发育障碍^[2]。2013年新出版的美国精神病学诊断手册第五版(DSM-Ⅴ)^{[3, 4]}对ASD进行了重新定义，删除了原来的5种分类，将其统一归类为孤独症谱系障碍，而且将ASD在DSM-Ⅳ-TR中的3个主要的临床症状减少到了2个，只包括社交障碍以及刻板、重复的行为，排除了语言发育障碍。ASD的患病率近年呈急剧上升趋势。美国疾病控制中心(CDC)调查显示在2001-2010年之间，ASD的发病率增加了2.2倍^{[5, 6]}。从历年来全球ASD的发病率来看：2009年，英国报道大约64个儿童中有1个患有ASD (1.57%)^[7]；2011年韩国的一项流行病学调查报道每38个儿童中就有一个罹患ASD (2.64%)^[8]。2014年, 美国疾病控制与预防中心(CDC)报道2010年每68个儿童中就有1个患有ASD(1.47%)。而我国只有个别地区的零星报告：天津市2004年报告患病率为1.1‰；北京市2007年报告患病率达1.34‰；台湾省2011年报道的患病率为2.9‰^[6]。国家统计局数据显示，截止至2011年末，我国0-14岁的人口总数为22 164万。如果按照目前各国普遍发病率计算，我国的儿童ASD患者约为300-600万。这些数字显示ASD已成为危害严重的全球公共健康问题。ASD的病因尚不明确，但是研究表明ASD是一个受遗传和环境因素共同作用影响的复杂疾病^[9]。

遗传因素在ASD的发病中起到非常重要的作用。近年来，遗传学研究发现了大量的候选易感位点或基因，而且部分研究结果不仅可以被不同的研究小组重复验证，还可以通过不同的技术和分析被重复验证^{[10, 11]}。在关于ASD的遗传学研究的众多基因里面，Csde1基因与孤独症的研究越来越引起各研究组的关注。前期研究中，通过全基因组关联研究，我们发现了一个孤独症易感基因Csde1，并且发现Csde1在孤独症患者和正常人脑中存在表达差异。Csde1基因所编码的蛋白属于一种RNA结合蛋白，包括5个CSD结构，且每个CSD结构结合RNA的能力各有差异^[12]。1990年，外国学者第一次在N-ras基因上游发现了Csde1基因，两者转录方向一致，且其表达量均在睾丸中随着发育成熟而上升^[13]。1994年，研究者发现在MCF7细胞中，Csde1主要分布在胞质中，在核中只有少量表达。1997年，研究人员发现在小鼠中敲除掉Csde1的启动子会导致小鼠在胚胎中期纯合致死^[14]。2005年，Cornelis等发现Csde1的5’UTR区含有一个核糖体进入位点(IRES)，且该位点可被PTB蛋白识别。研究表明当过表达PTB时，IRES的活性可被抑制且Csde1的表达也会降低，而下调或者敲除掉PTB则会使IRES活性提高，即Csde1将直接通过IRES调节其本身蛋白质的起始翻译^[15]。2009年，Duncan等研究发现在果蝇中，Csde1可与SXL蛋白形成复合物，通过PABP蛋白介导的途径抑制msl-2的mRNA表达，从而在果蝇中起到调节剂量补偿的作用^[16]。2013年，Kobayashi等通过电生理研究证实了Csde1可影响前小脑神经元的迁移^[17]。

但是在所有这些关于Csde1的研究中，没有一篇发现Csde1会参与孤独症发病的分子机制。因此要研究Csde1是否参与孤独症的发病机制过程，首先要了解Csde1的基本特性。本研究以此为立足点，展开一系列研究，最终基本确定了Csde1的基本生物学特性，这为阐明Csde1是否参与ASD的发病机制奠定了基础。

本实验所用的HEK293细胞来自医学遗传学国家重点实验室细胞库。细胞培养液为高糖-DMEM(Hyclone公司，500 ml)，10%胎牛血清(Hyclone公司，500 ml)，一抗鼠抗兔Anti-Csde1(rabbit)(SIGMA公司，100 μl)，二抗来自Jackson公司，BCA蛋白定量试剂盒(Thermo公司)，荧光显微镜(Leica公司)，PCR产物纯化试剂盒(QIAquich公司)。

通过比较各个剪切本之后，我们选择UCSC GENOME BROWSER中Csde1最长转录本(NM_001242891.1)作为标准序列，使用Primer3在线网站设计引物如下，Csde1-RT-F：5′-TACTTGGCCAAAATGCACAA-3′，Csde1-RT-R：5′-CTTCACAGACTCGCCAGACA-3′。

使用加入了10%胎牛血清(fetal calf serum，FBS)与1 mmol/L丙酮酸钠、1 mmol/L非必需氨基酸的高糖DMEM培养基培养HEK293细胞；细胞培养于37 ℃，5% CO₂培养箱，3 d传代一次。

细胞进行特定的处理时间后，以冰冻的1×PBS冲洗2次，直接以1 ml/孔加入Trizol，裂解细胞提取总RNA，检测其浓度和纯度，取5 μg总RNA进行逆转录，所得的cDND稀释5倍后取5 μl做PCR，反应体系10 μl，PCR程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃7 min，4 ℃保存。进行32个循坏。扩增后，PCR产物特异性用琼脂糖凝胶电泳进行检查。

对成年野生型小鼠进行体外灌注，固定脑组织，并在冰冻切片机中切片，切片自然晾干，室温复水5-10 min，1×PBST加BSA(含10%Triton)封闭透膜10 min，1×PBS洗1遍，用BSA配一抗，4 ℃血清孵育过夜，使用1×PBS洗3次，每次5 min，加二抗室温避光1 h，再用1×PBS洗3次，每次5 min封片固定，最后荧光显微镜观察。

从细胞培养箱取出培养好的细胞培养皿，去除培养基，加入固定液，室温下静置15 min。去除固定液，以1×PBS洗1次，加入渗透液，室温下静置10 min，挑出盖玻片置于一带盖子的平底盒中，底部预先铺好薄膜，细胞面向上。加入封闭液，室温静置30 min。盖玻片周围放入湿的吸水纸，用封闭液稀释抗体。去除封闭液，加入抗体，室温静置1 h，或4 ℃过夜，去除一抗，用1×PBS冲洗3次。加入1×PBS，室温静置5 min，去除1×PBS，如此重复洗5次，加入封闭液，室温静置30 min，用封闭液稀释抗体。去除封闭液，加入抗体，室温静置1 h，去除二抗，用1×PBS冲洗3次，加入1×PBS，室温静置5 min。去除1×PBS，如此重复洗7次，用1×PBS将DAPI稀释至1 μg/ml，加入稀释好的DAPI，室温静置2 min，去除DAPI，用1×PBS冲洗3次，用去离子水冲洗1次，向载玻片上加入1滴封片剂，将盖玻片缓慢扣在载玻片上，细胞所在的一面靠近载玻片，用吸水纸将多余的封片剂吸除，用指甲油固定盖玻片边缘。最后观察。

首先收集样品于EP管中，超声裂解，然后进行蛋白定量，最后通过电泳检测Csde1在胞质、细胞核以及线粒体中的表达情况。

由于基因功能的发挥与它在细胞内所处的位置密切相关，因此，在分析Csde1蛋白的功能时，必须了解它在细胞内的亚定位，这样才能做出合理的解释。通过免疫荧光技术可以清楚地看到Csde1荧光蛋白分布在细胞质中(图 1)，Western Blot的结果表示Csde1在线粒体及细胞核中有少量表达，而在细胞质中表达最多(图 2)。

图 1(Figure 1)

图 1 内源性Csde1蛋白在HEK293中的亚细胞定位 使用鼠抗兔Anti-Csde1标记Csde1(红色)，Tublin染细胞骨架(绿色)，DAPI染细胞核(蓝色)。在HEK293细胞中Csde1蛋白呈现细胞质分布。Merge为荧光显微镜下图与Tublin、DAPI染后的合并图片

图 2(Figure 2)

图 2 Csde1蛋白在HEK293中的表达分布 从左往右点样顺序依次为细胞核、细胞质、除线粒体外的细胞器、线粒体

了解基因在各组织中的表达情况，有助于我们进一步研究该基因所表达的蛋白的作用与机制。我们通过逆转录RT-PCR技术发现Csde1-mRNA在小鼠各组织及小鼠原代神经元中的表达情况各有不同(图 3)。

图 3(Figure 3)

图 3 Csde1的mRNA在小鼠各组织中的表达情况 使用琼脂糖凝胶电泳进行检查，从左至右分别是心脏、肝脏、肺、肾脏、骨骼肌、脑部、神经元中Csde1-mRNA的表达情况

为进一步研究同龄小鼠各脑区Csde1蛋白表达的分布情况，取B6小鼠脑区各部位组织，进行冰冻切片与免疫荧光实验。结果显示Csde1主要分布于大脑皮层、海马沟附近以及小脑的浦肯野细胞中(图 4，5)。

图 4(Figure 4)

图 4 Csde1在小鼠脑区的特异性表达情况 使用鼠抗兔Anti-Csde1标记Csde1(红色)。从上往下分别是皮层10倍镜下、皮层40倍镜下、海马沟10倍镜下、海马沟40倍镜下、小脑10倍镜下、小脑40倍镜下拍照。DAPI染细胞核(蓝色)。Merge为荧光显微镜下图与DAPI染后的合并图片

图 5(Figure 5)

图 5 Csde1在小鼠脑部普肯野细胞中的表达情况 分别使用anti-carbindin标记浦肯野细胞(红色)，Anti-Csde1标记Csde1(绿色)，DAPI染细胞核(蓝色)。分别取40倍镜下、100倍镜下拍照。Merge为carbindin-D28与DAPI染后的合并图片，negative为阴性对照

由于基因功能的发挥与它在细胞内所处的位置密切相关，因此在分析Csde1蛋白的功能时，首先了解它在细胞内的亚定位，虽然早前已有文章报道Csde1主要分布于鼠源细胞MCF7的胞质中，核中也有少量表达，但是一直没有文献报道其在人源细胞中的表达分布情况，所以我们利用人胚肾细胞HEK293研究了Csde1在人源细胞中的分布表达情况。结果发现，无论在人源细胞还是鼠源细胞中，Csde1的分布没有太大差别，均主要分布于胞质中，线粒体及细胞核中少量表达，这提示我们Csde1基因在人和鼠中发挥的功能应该类似，后期实验可以以小鼠为模型来研究Csde1的蛋白功能。

对小鼠各组织Csde1基因的mRNA表达情况进行检测，我们发现Csde1在小鼠各组织中均有不同程度表达，提示我们Csde1基因对于生物体维持正常的生理功能具有重要作用，该基因突变导致蛋白丧失功能可能对于生物体造成严重伤害。此外，通过研究Csde1在小鼠脑区的表达情况，我们发现Csde1主要分布于大脑皮层、海马沟附近、以及小脑中。其中，在小鼠小脑的浦肯野细胞中表达尤其丰富。根据目前国内外针对孤独症的研究，已有不少报道证实孤独症患者的发病与小脑密切相关，国外研究团队发现小脑浦肯野细胞数量的减少，树突棘密度增加对于孤独症的发病具有重大贡献。我们的研究结果表明Csde1在浦肯野细胞中表达丰富，提示其可能与小脑功能的正常发挥具有密切联系。

但本研究的结果对揭示Csde1在孤独症发病机制中的作用远远不足，后期建议建立合适的敲除小鼠模型，重点探究当把Csde1敲除后会对小鼠小脑功能的发挥有何影响，并利用合适的行为学实验来检测相应敲除鼠是否有孤独症三大核心症状的行为表型。另外，已有报道证实Csde1能结合RNA并影响其转录翻译，后期可以通过设计合理的实验来探索Csde1能结合并影响哪些RNA的表达。