生血宁片^{[1, 2]}是我国第一个采用最大样本量(大于2 000例)进行Ⅳ期临床研究的中药新药，也是我国唯一有生殖毒理实验数据支持的孕产妇贫血防治安全用药^[3]，因其作用机理明确、针对性强，疗效确切且安全性高，该产品目前已成为抗贫血药处方药首选品种，临床用药领先品牌。临床研究表明，它具有明显的益气补血功效，适用于缺铁性贫血患者^{[4, 5]}。为了评价其安全性，本实验进行了生血宁片Beagle犬经口给药6个月的长期毒性实验研究^{[6, 7]}。

生血宁片(每片含蚕砂提取物50 mg)，由武汉联合药业有限责任公司提供, 规格：每片0.25 g，批号：20140204。无需配制，直接将生血宁片投入犬口腔咽部给药，以每周体重计算给药量多少。

Ⅰ级Beagle犬购于成都达硕生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2013-24，实验动物质量合格证号：NO.0018245。

XK3100-B2+TCS-150A电子计重台秤，仪器编号：BKY-DW-013，BKY-DW-024、BKY-DW-025，购于上海友声衡器有限公司；十六道生理记录仪，仪器编号：BKY-AQ-002，购于BIOPIC Systems公司；美生MB-1830全自动血液分析仪，仪器编号：BKY-ZX-023，购于四川美生科技有限公司；XQ-2型血球分类计数器，仪器编号：BKY-ZX-003，购于江阴文林医疗器械五金厂；XSZ-H生物显微镜，仪器编号：BKY-ZX-008，购于重庆光电仪器总公司；日本岛津UX620H型电子天平(分辨值0.001 g)，仪器编号：BKY-TJ-001，购于日本岛津(香港)有限公司。

取检疫及适应性观察合格Ⅰ级Beagle犬40只，犬龄6-7月，雌雄各半，分性别，根据体重按随机分组法分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组4个组，每组10只，雌雄各半^{[6, 7]}。

选择与临床口服给药相一致给药途径，供试品直接投至Beagle犬咽部，让其自然吞服，给药后张开犬口腔检查以确认吞服情况。对照组将与高剂量组药片体积相同的纯化水注入口腔让其咽下。

供试品组：本品为已上市品种，目前未见明显毒性报道。根据委托方推荐供试品今后临床成人重度患者最大口服剂量可能为“一次4片，一日3次”，设计高、中和低剂量组分别给予20、10和5片/kg(1 000、500和250 mg蚕砂提取物/kg)，分别相当于上述成人临床剂量的100、50和25倍。对照组：给予与高剂量组药片等体积的纯化水(见表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 生血宁片Beagle犬长期毒性试验给药方案 组别 受试物 给药途径 药片含量 (mg蚕砂提取物/片) 给药片数 (/kg) 给药频率 (次/d) 给药剂量 [mg蚕砂提取物/(kgd)] 给药周期 (d) 停药天数 (d) 对照组 纯化水 P.O - 4 ml 1 - 180 30 高剂量组 生血宁片 P.O 50 20片 1 1 000 180 30 中剂量组 生血宁片 P.O 50 10片 1 500 180 30 低剂量组 生血宁片 P.O 50 5片 1 250 180 30

表 1 生血宁片Beagle犬长期毒性试验给药方案

每天给药1次(每周休息1天不给药)，连续给药180 d，恢复期30 d。

给药第90天、第180天和恢复期结束的次晨，所有受试动物取上肢隐静脉全血，其中取0.3 ml全血加入含50 μl 2.2%EDTA-K₂抗凝剂(60-80 ℃预先烘干)的离心管中抗凝，血液分析仪测定白细胞计数(WBC)，中性粒细胞计数(GRM)，淋巴细胞数(LYM)，中间细胞数(MID)，中性粒细胞率(GR%)，淋巴细胞率(LY%)，中间细胞率(MO%)，红细胞数(RBC)，血红蛋白(HGB)，红细胞压积(HCT)，平均红细胞体积(MCV)，平均红细胞血红蛋白含量(MCH)，平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)，红细胞体积分布宽度(RDWS)，血小板计数(PLT)，血小板压积(PCT)，平均血小板体积(MPV)，血小板体积分布宽度(PDWS)。

给药180 d结束后次日，每组取6只动物(3♂3♀)，麻醉后股动脉放血处死，进行全面细致的系统尸解，检查项目包括体表、胸腹壁皮下组织、腹腔及盆腔、胸腔、颈部组织及胸腔器官、腹腔器官、盆腔器官、眼、颅腔、脊髓、坐骨神经、鼻中隔等。同时，称取心、肝、脾三个器官，并计算体重脏器指数和脑脏器指数。

其余每组Beagle犬恢复期结束次日同法进行系统尸解及体重脏器指数和脑脏器指数检查。

动物体重、脏器指数、血液生化检查等计量资料，采用Excel软件求均数和标准差，采用R检验对各组数据进行正态性检验，若数据符合正态性，则采用F检验方差齐性，然后选择t检验进行统计，数据用x±s表示，显著性水平P=0.05；若数据不符合正态性，则采用非参数检验。

病理检测数据为等级资料数据，采用软件SPSS 17.0“非参数检验”的“两个独立样本”进行统计分析。

在实验期间，生血宁片各剂量组和正常对照组Beagle犬的外观、行为、排泄物、摄食量等状况正常，未出现恶心呕吐、流涎、嗜睡、肌颤等现象，无一死亡；停药观察30 d，亦无变化。

生血宁片各剂量组动物体重正常增长，与正常对照组比较，无显著性差异(P＞0.05)。见图 1。生血宁片各给药组体重测定值与对照组比较均无明显差异(P＞0.05)，但生血宁片给药组体重增长率(%)均超过对照组10%左右。

图 1(Figure 1)

图 1 生血宁片Beagle犬长期毒性试验体重增长趋势

给Beagle犬连续用药180 d和停药30 d后，取静脉血进行血液学指标检查。结果：生血宁片各剂量组动物相关指标未见明显改变，均在生理范围之内，与正常对照组比较，无显著性差异(P＞0.05)，见表 2、3。

表 2(Table 2)

表 2 血常规(红细胞系统)检查(x±s) 组别 RBC (1012/L) HGB (g/L) HCT (%) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/L) RDWS (fl) RC%(%) 给药 180 d 检查 对照组 5♂5♀ 3.83±0.29 126.90±14.71 26.41±2.22 69.00±1.76 32.90±1.66 477.00±23.12 22.10±0.32 0.72±0.13 高剂量组 5♂ 5♀ 3.75±0.17 120.00±6.34 25.88±1.36 69.10±3.00 32.00±1.76 465.00±14.34 21.80±1.03 0.74±0.12 中剂量组 5♂ 5♀ 3.80±0.26 125.80±11.90 26.88±2.65 70.60±2.84 33.00±1.63 469.00±13.70 21.70*±0.48 0.72±0.15 低剂量组 5♂5♀ 3.64±0.26 120.30±8.65 25.50±1.77 70.10±2.51 32.90±1.37 473.00±14.94 21.70±0.95 0.75±0.16 恢复 30 d 检查 对照组 5♂ 5♀ 5.24±1.05 160.75±14.89 34.93±6.09 67.00±2.45 31.50±4.36 467.50±55.00 22.00±0.00 0.90±0.18 高剂量组 5♂ 5♀ 4.57±0.61 149.25±21.03 30.93±3.71 67.75±1.50 32.75±0.50 482.50±9.57 21.25±0.50 0.78±0.31 中剂量组 5♂ 5♀ 5.12±0.86 172.00±39.00 32.28±4.88 63.25±1.71 33.50±3.00 530.00±43.20 22.50±1.29 0.73±0.13 低剂量组 5♂ 5♀ 4.81±0.42 160.25±18.41 31.43±2.33 65.50±4.80 33.25±1.71 507.50±35.00 22.00±1.41 0.75±0.19 给药组与对照组比较，P＞0.05

表 2 血常规(红细胞系统)检查(x±s)

表 3(Table 3)

表 3 血常规(白细胞及分类)检查(x±s) 组别 WBC(109/L) GRM(109/L) LYM(109/L) MID(109/L) GR%(%) LY%(%) MO%(%) 给药 180 d 检查 对照组 5♂ 5♀ 5.07 ±1.37 1.41 ±0.73 2.86 ±0.61 0.80 ±0.31 26.69±8.07 57.89±10.09 15.42±2.55 高剂量组 5♂ 5♀ 5.64±1.79 1.43±0.48 3.33±1.10 0.88±0.32 25.58±5.06 58.94 ±6.19 15.48±1.64 中剂量组 5♂ 5♀ 5.24±0.94 1.49 ±0.50 2.90±0.83 0.85 ±0.14 28.57 ±8.12 55.03 ±9.15 16.40±2.32 低剂量组 5♂ 5♀ 4.97±1.02 1.43±0.42 2.73±0.55 0.81±0.19 28.48±4.44 55.23±5.44 16.29±1.61 恢复 30 d 检查 对照组 5♂ 5♀ 7.58±0.76 2.13±0.29 4.03±0.63 1.43±0.29 28.35±5.49 52.98±4.07 18.68±1.88 高剂量组 5♂ 5♀ 7.48±1.39 2.63±0.82 3.45±0.75 1.40±0.29 34.78±6.57 46.53±7.76 18.70±1.33 中剂量组 5♂ 5♀ 9.28±5.16 2.28±1.00 5.20±3.15 1.80±1.07 25.50±4.56 55.35±5.47 19.15±1.55 低剂量组 5♂ 5♀ 7.20±2.98 2.35±1.09 3.45±1.30 1.40±0.68 32.10 ±6.57 48.90±8.21 19.00±1.97 给药组与对照组比较，P＞0.05

表 3 血常规(白细胞及分类)检查(x±s)

给Beagle犬连续用药180 d和停药30 d后，处死，计算脏器系数。结果：生血宁片各剂量组动物脏器系数无明显变化，与正常对照组比较，无显著性差异(P＞0.05)，见表 4。

表 4(Table 4)

表 4 心、肝和脾脏器指数检查(x±s) 组别 体重(kg) 心 肝 脾 g g/g脑 g/kg体重 g g/g脑 g/kg体重 g g/g脑 g/kg体重 给药 180 d 检查 对照组 3♂3♀ 9.36 ±0.74 68.57±2.72 0.78±0.16 7.37±0.78 253.29 ±38.47 2.66±0.43 26.97±2.60 22.71±5.77 0.26±0.07 2.43±0.61 高剂量组 3♂ 3♀ 9.80±0.70 71.80±9.39 0.89±0.18 7.36±1.11 248.67±22.17 3.07±0.34 25.45±2.63 22.18±6.32 0.27±0.08 2.29±0.75 中剂量组 3♂ 3♀ 9.83±0.55 71.18±10.97 0.85±0.13 7.27±1.25 252.21±21.63 2.99±0.21 25.64±1.46 22.89±4.29 0.27±0.05 2.33±1.45 低剂量组 3♂ 3♀ 9.70±0.69 72.36±11.84 0.91±0.16 7.48±1.29 255.19±32.00 3.23±0.55 26.24±1.56 21.00±3.75 0.26±0.04 2.17±0.38 恢复 30 d 检查 对照组 2♂ 2♀ 9.42±1.03 65.57±8.89 0.73 ±0.06 7.00±0.95 266.49±52.40 2.94±0.18 28.16±3.74 21.45±6.54 0.26±0.05 2.25±0.53 高剂量组 2♂ 2♀ 10.28±0.86 80.56±20.89 0.84±0.17 7.76±1.40 281.94±59.08 2.95±0.38 27.22±3.78 26.46±5.71 0.28±0.03 2.56±0.38 中剂量组 2♂ 2♀ 9.81 ±1.27 79.55 ±9.62 0.85±0.15 8.16±0.91 288.70±34.89 3.08±0.34 29.49±1.19 29.38±4.18 0.32±0.08 3.03±0.56 低剂量组 2♂ 2♀ 10.07±0.27 66.22±3.84 0.74±0.05 6.59±0.47 275.51±25.16 3.06±0.18 27.39±2.62 23.45±4.59 0.26±0.06 2.33±0.43 给药组与对照组比较，P＞0.05

表 4 心、肝和脾脏器指数检查(x±s)

表 4所示，给药180 d及恢复30 d心、肝和脾脏器指数检查，各给药组与对照组比较未见统计学差异(P＞0.05)。

Beagle犬按20、10、5片/kg(1 000、500和250 mg蚕砂提取物/kg)生血宁片投入咽部口服给药，相当于委托方推荐的临床成人重度患者最大用量的100、50和25倍，每天1次(每周休息1 d)，连续180 d，然后停药恢复30 d，未见动物死亡。各剂量组的体温、血液学检查、血液生化检查、脏器检查也未发现毒性反应。实验表明，20片/kg(1 000 mg蚕砂提取物/kg)及以下剂量为安全剂量。

生血宁片为国家中药品种保护二级药物，按照国家食品药品监督管理局要求，扩大对该药的研究范围，完成犬的长期毒性试验研究，以证明该药长期反复用药的安全性。Beagle犬形态体质均一，血液循环系统发达，且器官功能也具备一致性，因此在试验中反应一致性好，尤其对环境适应能力及抗病能力较强，因此该犬适合药理、毒理等研究。

本次试验只是通过动物试验来观察生血宁片的临床用药安全性，后续研究应当观察药物在真实世界的用药安全性，进行多中心多科室多样本量数据采集分析工作，从临床观察研究上寻找新的证据支撑其药物安全性。