武汉大学学报(医学版)   2016, Vol. 37Issue (1): 25-28   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2016.01.006.
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引用本文 

袁保东, 张炎林, 陈国玺, 刘小玉, 姚芳, 徐静, 王先松. N-乙酰半胱氨酸对异烟肼和利福平联合应用所致小鼠肝损伤保护作用[J]. 武汉大学学报(医学版), 2016, 37(1): 25-28. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2016.01.006.
YUAN Baodong, ZHANG Yanlin, CHEN Guoxi, LIU Xiaoyu, YAO Fang, XU Jing, WANG Xiansong. Protective the Treatment with Effect of N-acetylcysteine on Hepatic Damage Induced by the Combination of Isoniazid and Rifampicin in Mice[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2016, 37(1): 25-28. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2016.01.006.

作者简介

袁保东，女，1966-，主任医师，主要从事结核病和肺部疾病诊治研究

基金项目

武汉市卫计委资助项目(编号：WX11C30)

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收稿日期：2015-01-11
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N-乙酰半胱氨酸对异烟肼和利福平联合应用所致小鼠肝损伤保护作用
袁保东 1, 张炎林 1, 陈国玺 1, 刘小玉 1, 姚芳 1, 徐静 2, 王先松 2     
1. 武汉市结核病防治所 湖北 武汉 430030;
2. 华中科技大学同济医学院 湖北 武汉 430030
收稿日期：2015-01-11
基金项目：武汉市卫计委资助项目(编号：WX11C30)
作者简介：袁保东，女，1966-，主任医师，主要从事结核病和肺部疾病诊治研究
[摘要] 目的: 探讨N-乙酰半胱氨酸对异烟肼和利福平联用所致小鼠肝损伤的保护作用及其可能机制。 方法: 32只昆明鼠随机分为4组(每组8只)后给予如下治疗：腹腔注射异烟肼和利福平(肝损伤组)、腹腔注射N-乙酰半胱氨酸(NAC)30 min后再腹腔注射异烟肼和利福平(NAC保护组)、腹腔注射NAC (NAC对照组)和腹腔注射生理盐水(对照组)。治疗14 d后处死小鼠，取眼球血，测量血清谷氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性；取小鼠肝组织并测量肝指数(肝指数=肝重/体重)，部分肝组织常规石蜡包埋切片，光镜观察肝组织形态结构特征；部分肝组织均浆，检测其中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。 结果: 肝损伤组小鼠肝细胞呈不同程度的水变性和脂肪变性及局灶性坏死溶解，NAC保护组小鼠肝细胞呈轻度水变性和脂肪变性，未见肝细胞坏死。肝损伤组及NAC保护组小鼠肝指数(64.38±0.63及60.54±0.57)、血清ALT (82.81±4.75及68.70±5.81) U/L及AST活性(173.56±6.30及119.92±4.58) U/L显著高于对照组[57.48±0.53, (33.58±5.68) U/L、(85.84±5.20) U/L](P＜0.01)；NAC保护组小鼠肝指数、血清ALT及AST活性明显低于肝损伤组(P＜0.01)；与对照组(0.83±0.12、125.56±5.36)比较，肝损伤组小鼠MDA含量[(3.22±0.17) nmol/mgprot]显著升高，SOD活性[(88.44±5.52) U/mgprot]显著降低(P＜0.01)；与肝损伤组比较，NAC保护组MDA含量[(1.78±0.27) nmol/mgprot]明显降低，SOD活性[(106.85±3.66) U/mgprot]明显升高(P＜0.01)。 结论: 异烟肼与利福平联合应用能引起小鼠较严重的肝损伤，N-乙酰半胱氨酸能够减轻这种损伤作用，其保护机制可能与增加机体谷胱甘肽(GSH)含量，从而减轻脂质过氧化反应有关。
关键词： N-乙酰半胱氨酸    异烟肼    利福平    损伤，肝脏保护    脂质过氧化    
Protective the Treatment with Effect of N-acetylcysteine on Hepatic Damage Induced by the Combination of Isoniazid and Rifampicin in Mice
YUAN Baodong1, ZHANG Yanlin1, CHEN Guoxi1, LIU Xiaoyu1, YAO Fang1, XU Jing2, WANG Xiansong2     
1. Wuhan Institute of Tuberculosis Prevention, Wuhan 430030, China;
2. Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
[Abstract] Objective: To investigate the protective action of N-acetylcysteine on hepatic damage caused by the treatment with the combination of isoniazid and rifampicin in mice. Methods: Kunming mice were injected intraperitoneally with saline (control), N-acetylcysteine (NAC), combination of isoniazid (I) and rifampicin (R) (I+R), or NAC and I+R (NAC+I+R) once every day. After 14 days, the liver index (LI), alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) activity in serum and the level of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) activity in liver tissues were measured respectively. Hepatic tissue morphology was observed under light microscope. Results: Macroscopic analysis revealed that coadministration of isoniazid and rifampicin led to severe liver tissue injury, including a wide range of hepatocellular vascular congestion, fatty change and local necrosis, whereas the administration of NAC produced a significant reduction of isoniazid and rifampicin-induced hepatotoxicity. The LI, ALT and AST activities in I+R or NAC+I+R group were significantly elevated when compared with control group. The LI, activity of ALT and AST in serum, and MDA levels in liver tissues in NAC+I+R group were significantly lower than those in I+R group, but the SOD activity in NAC+I+R group increased significantly in comparison with I+R group. Conclusion: Co-administration of isoniazid and rifampicin was able to cause severe hepatic damage. Pre-administration of NAC reduced the side-effect induced by the treatment with the combination of isoniazid and rifampicin. NAC probably exerted its protective action by increasing glutathione (GSH) production, thereby decreasing lipid peroxidation.
Key words: N-acetylcysteine    Isoniazid    Rifampicin    Hepatoprotection    Lipid Peroxidation    

异烟肼、利福平为抗结核化疗一线方案的核心药物，但异烟肼和利福平在发挥抗结核疗效的同时，也导致肝脏发生不同程度的损伤，尤其是两种药物联合应用时可增加肝损害的发生率和严重程度, 严重者可能导致肝坏死甚至肝功能衰竭而死亡[1], 成为阻碍结核病防治工作的一大难题。因此，寻找不影响抗结核药物疗效的保肝治疗具有重要的临床意义。

目前的研究表明，氧化应激是异烟肼和利福平联用致肝损伤的机制之一[2]。增强细胞的抗氧化防御系统，能抵抗许多药物或化学物质的氧化性损伤。还原性谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)能将过氧化脂质和过氧化氢转变为无毒的水和醇，是对抗氧化应激的重要物质。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylCysteine，NAC)能增加细胞内GSH的含量和活性，对铅[3]、全氟异丁烯[4]、局部缺血再灌注[5]等所致的氧化性损伤均有一定的保护作用。本研究探讨了NAC对异烟肼、利福平联用所致肝损伤的保护作用及其可能的机制。

1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物

雌性健康昆明小鼠32只，3-4周龄，平均体重为(20±2) g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。

1.1.2 实验药物和试剂

异烟肼注射液(天津金耀氨基酸有限公司，药品批号：1305211)，注射用利福平(重庆华邦制药股份有限公司，药品批号：20130442)及乙酰半胱氨酸(NAC)注射液(杭州民生药业有限公司，药品批号：1304293)使用时均用0.9 %生理盐水配制成相应浓度。谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验方法 1.2.1 实验动物分组与模型

小鼠随机分为4组(8只/组)，腹腔注射不同的药物，每天1次，每只注射量均为每克体重每天(g·5d)0.002 ml，具体分组如下：对照组：腹腔注射0.9%生理盐水；NAC对照组：腹腔注射NAC，0.4 mg/(g·5d)；肝损伤组：腹腔注射异烟肼0.1 mg/(g·5d)和利福平0.1 mg/(g·5d)；NAC保护组：腹腔注射NAC 0.4 mg/(g·5d)，30 min后再行腹腔注射异烟肼0.1 mg/(g·5d)和利福平0.1 mg/(g·5d)。每组连续给药2周。所用药物浓度是根据预实验结果测算得出，确保不会因为用药浓度太高引起肝脏严重损伤、实验鼠死亡，从而导致实验无法继续，同时也不会因为药物浓度太低而无法获得肝细胞受损的动物模型。

1.2.2 血清ALT及AST活性测定

全部小鼠末次给药禁食不禁水，16 h后称体重，摘眼球取血，收集血清，按试剂盒介绍的方法，检测血清ALT及AST活性。

1.2.3 肝指数测量及形态学观察

处死小鼠，低温下迅速完整取肝，称重，计算肝指数(肝指数=肝重/体重)。取部分肝组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察肝组织形态结构。

1.2.4 肝组织SOD活性及MDA含量测定

取新鲜肝组织，准确称重，按重量(g):体积(ml)=1 : 9的比例，加入生理盐水，冰水浴条件下充分匀浆，4 ℃离心(2 500 r/min)20 min，取上清液，用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric Acid, TBA)法检测其中MDA含量，用WST-1法测量SOD活性，详细检测方法按试剂盒说明操作。

1.3 数据的统计学分析

所有的数据均采用SPSS 18.0统计软件进行分析。计量资料均用x±s表示。计量资料采用单因素方差分析和LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 肝组织形态学变化

对照组和NAC对照组，鼠肝小叶结构完整，肝细胞形态结构正常，细胞排列规则(图 1)；肝损伤组：肝细胞肿胀，细胞排列紊乱，肝细胞呈脂肪变性(图 2)或/和不同程度的水变性(图 3)，以及局灶性肝细胞坏死、炎性细胞浸润(图 4)；NAC保护组：肝细胞肿胀不明显，大部分肝细胞排列规则，部分细胞呈轻度脂肪变性(图 5)或呈轻度水变性(图 6)，未见肝细胞坏死。

图 1-6 各组肝组织形态照片 图 1  对照组(HE×100)；图 2  肝细胞脂肪变性(HE×400)；图 3  肝细胞水变性(HE×400)；图 4  肝细胞坏死及炎性细胞浸润(HE×400)；图 5  轻度脂肪变性(HE×400)；图 6  轻度水变性(HE×400)
2.2 肝指数及血清酶活性

对照组与NAC组在肝指数[NAC组：(57.47±0.68) mg/g]、血清酶ALT[NAC组：(36.70±3.00) nmol/mgpro]及AST[NAC组：(82.34±2.96) nmol/mgpro]活性无显著差异。肝损伤组小鼠肝指数、血清ALT及AST活性显著高于对照组(P＜0.01)；NAC保护组与肝损伤组比较，小鼠肝指数、血清ALT及AST活性明显降低(P＜0.01)，结果见表 1。

表 1 对照组、肝损伤组及NAC保护组中肝指数和血清ALT及AST活性(x±s)
2.3 肝组织MDA含量及SOD活性

NAC组与对照组比较, MDA含量(NAC组：0.54±0.14 nmol/mgpro)及SOD活性(NAC组：124.18±4.20 nmol/mgpro)无显著差异。肝损伤组与对照组比较，小鼠MDA含量显著升高(t=32.49，P＜0.01)，SOD活性显著降低(t=-13.65，P＜0.01)；NAC保护组与肝损伤组比较，MDA含量明显降低(t=-12.77，P＜0.01)，SOD活性明显升高(t=7.86，P＜0.01)，结果见表 2。

表 2 对照组与肝损伤组肝组织中MDA含量及SOD活性(x±s)
3 讨论

肝指数反映肝组织肿胀的严重程度，而ALT和AST活力与肝细胞损伤的严重程度相关。本研究中，肝损伤组及NAC保护组小鼠肝指数、ALT及AST活力均显著高于对照组，提示异烟肼与利福平联用能够引起明显的肝细胞损伤，但NAC保护组小鼠肝指数、ALT及AST活力显著低于肝损伤组，表明NAC对异烟肼与利福平联用所致肝损害具有一定的保护作用，这与Attri[6]及Singh[7]等的研究结果一致，他们在体外细胞实验中发现，NAC能够对抗抗结核药物所致的肝损害。

丙二醛(MDA)为脂质过氧化产物；超氧化物歧化酶(SOD)是防御超氧负离子损害的重要酶；两者在机体氧化和抗氧化平衡中起着重要的作用。MDA含量的高低间接反映了细胞脂质过氧化的严重程度[8]，而SOD活力的高低反映了细胞清除自由基能力的大小。本次结果显示损伤组肝匀浆MDA含量增高，SOD活性降低，说明异烟肼、利福平两者联用引起细胞脂质过氧化增强，细胞清除自由基的能力下降，细胞氧化与抗氧化系统失衡。预用N-乙酰半胱氨酸的保护组与相应损伤组比较肝匀浆MDA含量降低，SOD活性增高，说明N-乙酰半胱氨酸护肝机制与减轻细胞脂质过氧化程度、提高SOD活性、增强机体清除自由基的能力等有关。这一结果与Attri[6]及Rana[9]等的报告一致。

正常情况下，大多数体内产生的自由基由GSH消耗，如果GSH消耗过多或者产生不足就会导致组织的脂质过氧化损伤[10]。而NAC作为GSH的前体物质，可以使机体内GSH合成酶含量增加, 并可在细胞内脱乙酰化生成半胱氨酸，提供体内GSH生物合成的必需氨基酸，增加细胞内GSH的含量和活性；此外，NAC可以直接与氧自由基发生非酶促反应[11]。NAC还具有显著的抗炎功能，可以抑制炎性细胞因子的产生释放，减轻机体的炎性损伤[12]，从而保护肝细胞。本实验中，与肝损伤组相比，NAC保护组小鼠SOD含量增加，很好的验证了这一理论。

综上所述，异烟肼与利福平联合应用能引起小鼠较严重的肝损伤，N-乙酰半胱氨酸能够减轻这种损伤作用，其保护机制可能与增加机体谷胱甘肽(GSH)含量，从而减轻脂质过氧化反应有关。本研究为NAC在临床上用于预防抗结核药引起的肝损伤提供了进一步的理论依据。

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