2017, Vol. 38
, 2. 武汉科技大学信息科学与工程学院 湖北 武汉 430065;
3. 华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科 湖北 武汉 430030
2. School of Information Science and Engineering, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430065 , China;
3. Dept. of Cardiology, Tongji Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
2型糖尿病是发病率很高的慢性病，据流行病学研究报道，目前全球已经有超过2.25亿人患有2型糖尿病，而且其发病率和患病人数仍呈不断增长的趋势[1]。2型糖尿病发病主要表现为高糖血症和胰腺功能障碍，其中胰岛β细胞数量和功能障碍是糖尿病发生发展的主要因素，保护β细胞及改善其功能是预防和治疗糖尿病的重要策略[2]。可溶性环氧化酶水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)是代谢环氧-二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)的主要酶类，通过将EETs降解为生物活性明显减弱的二羟基-二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids,DHET)发挥作用[3]。基因敲除法或化学试剂抑制sEH功能，从而间接增加EETs水平，已被证明对心、脑及肾脏损伤模型均有保护作用。可溶性环氧化酶水解酶在心血管系统中同样发挥重要作用[4]。在心肌缺血再灌注实验中，sEH基因敲除动物的心功能迅速恢复，心肌梗死面积缩小，其机制可能是通过激活PI3K信号通路和心肌K+通道[5]；可溶性环氧化酶水解酶抑制剂(soluble epoxide hydrolase inhibitor,sEHI)的作用可逆转心肌肥厚并改善心室重构，还可以改善血管重构，抑制血管炎症反应[6]；sEH基因突变被证明与冠状动脉粥样硬化关系密切[7]。但sEHI能否保护KKAy小鼠胰岛β细胞，哪些机制可能在此过程中发挥作用目前尚不清楚。
本研究选用环氧化酶水解酶抑制剂-1471，即trans-4- -benzoic acid (sEHI-1471)干预2型糖尿病KKAy小鼠，探讨sEHI-1471对KKAy小鼠胰岛β细胞的保护作用及其机制。
1 材料与方法 1.1 材料10周龄雄性KKAy小鼠购自北京华阜康实验动物有限公司，同周龄雄性C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。葡萄糖检测试剂盒购自北京中生北控生物科技股份有限公司；胰岛素放射免疫试剂盒购自美国Detroit R&D公司；凋亡检测试剂盒购自美国Detroit R&D公司；14，15-DHET ELISA试剂盒购自美国Detroit R&D公司；
1.2 实验动物分组及干预动物分组与观察：在饮用水中加入sEHI-1471制成终浓度为8 mg/L的饮用水或加入等体积生理盐水。10周龄KKAy小鼠随机分为2组: 对照组(18只)和sEHI-1471组(18只)；sEHI-1471组饮用水中含终浓度为8 mg/L的sEHI-1471，对照组饮用水中含等体积的生理盐水，C57BL/6J小鼠(18只)设为正常组饮用水不作任何处理。在无特定病原体(SPF)级实验动物中心进行饲养和实验，并自由摄取食物和饮水。所有实验动物操作程序符合NIH实验动物管理与使用指南及中国科学院实验动物管理规范所制定的标准；干预前采尾静脉血测定空腹血糖(FBG)和空腹血清胰岛素(FINS)，并用稳态模型评估法计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)；实验结束前1 d早8∶00至次日8∶00代谢笼留取24 h尿标本，二甲胺防腐，3 000 r/min离心15 min 收集上清，分装后置于-80 ℃低温冰箱保存备用。实验结束前所有动物空腹12 h，心脏采血留取血液标本，3 000 r/min离心15 min收集血清，存于-80 ℃低温冰箱备用；完成后处死动物，取胰腺组织放入做好相应标记的冻存管用液氮冷冻后转入-80 ℃低温冰箱保存备用或4％甲醛溶液中过夜固定，脱水浸蜡石蜡包埋后，常规制作切片。
1.3 胰岛β细胞凋亡的检测末端脱氧核糖核酸缺口标记法(TUNEL)法，实验步骤按照试剂盒说明书进行。光镜下观察胰腺组织切片，细胞核呈棕色为凋亡细胞。在高倍视野(400×)下每张切片选取3个阳性细胞较多的视野，计算平均每100个胰岛细胞中阳性细胞所占的百分比，即为胰岛细胞凋亡率。
1.4 Western Blot检测小鼠胰腺组织中相关蛋白的表达取胰腺组织放入1.5 ml洁净小EP管中，每管加入250 μl 组织蛋白裂解液，在自动匀浆机上磨碎组织，匀浆液冰 上静置20 min后4 ℃，12 000 r/min离心30 min，留取上清，BCA法测蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶(分离胶8%，浓缩胶5%)垂直电泳分离，电转至PVDF膜上，转好的膜室温下封闭1 h。依次加入多克隆兔抗Bax抗体、多克隆兔抗Bim抗体、多克隆兔抗Bid抗体、多克隆兔抗Bcl-xL抗体、多克隆兔抗Bcl-2抗体4 ℃孵育过夜后加入二抗室温下孵育30 min，增强的化学发光试剂显色曝光。
1.5 统计学处理所有数据均以均数±标准误( x±s )表示，应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，各分组组间差异采用单因素方差分析(ANOVA)，两样本均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 sEHI-1471干预前及干预后小鼠体重、FBG、FINS和HOMA-IR的变化实验动物分组同前。干预前，与正常组小鼠比较，sEHI-1471组及对照组小鼠体重、FBG、FINS水平和HOMA-IR均显著升高(P＜0.05)；sEHI-1471组与对照组两组间比较各指标无显著差异(P>0.05)，详见表 1。干预前对照组和sEHI-1471组小鼠血糖与胰岛素水平均显著升高，提示KKAy小鼠的病理生理特点与糖尿病相符。sEHI-1471干预3周后，与正常组小鼠比较，对照组小鼠体重、FBG、FINS水平和HOMA-IR均显著升高(P＜0.05)，提示KKAy小鼠作为2型糖尿病模型均有稳定性。与对照组相比，sEHI-1471组体重、FBG、FINS水平和HOMA-IR均显著降低(P＜0.05)，详见表 1。提示sEHI-1471对糖尿病小鼠有一定的治疗作用。
|
表 1 sEHI-1471干预前各组小鼠FBG、FINS与HOMA-IR水平(x±s ，n=18) |
14,15-DHET为EETs经sEH代谢所产生的功能性代谢产物，干预结束前1 d收集24 h尿液，ELISA检测每组小鼠尿中14,15-DHET的含量。结果显示正常组(Normal)为(5.40±0.27) ng/ml，对照组(Control)为(6.21±0.45) ng/ml，sEHI-1471干预组为(13.24±0.41)ng/ml；与正常组相比，对照组14,15-DHET含量无明显改变(P>0.05)，提示生理盐水对14,15-DHET 生成无显著影响；与对照组相比，sEHI-1471干预后14,15-DHET含量显著增加(P＜0.05)，提示sEHI-1471可以抑制可溶性环氧化酶水解酶活性。
2.3 sEHI-1471对胰岛细胞凋亡的影响TUNEL染色可见KKAy小鼠胰岛细胞内较多凋亡细胞，表现为细胞核固缩，染色呈棕黄色。相对于正常组，对照组小鼠胰岛细胞内凋亡细胞数目明显增加(P＜0.05)，相对于对照组的生理盐水，sEHI-1471的干预能显著减少凋亡胰岛细胞的数目(P＜0.05)，如图 1。
|
图 1 TUNEL法检测各组小鼠胰岛细胞凋亡情况 与正常组比较,*P＜0.05；与对照组比较,#P＜0.05 |
Western Blot检测结果显示，与正常小鼠相比较，对照组小鼠胰腺组织中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表达水平显著减少(P＜0.05)，促凋亡蛋白Bax，Bim和Bid表达水平显著增加(P＜0.05)。与对照组比较，sEHI-1471组小鼠胰腺组织中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表达水平显著增加(P＜0.05)，而促凋亡蛋白Bax，Bim和Bid表达水平显著减少(P＜0.05),如图 2。
|
图 2 Western Blot 检测各组小鼠胰腺Bax、Bim、Bid、Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达 与正常组比较,*P＜0.05；与对照组比较，#P＜0.05 |
2型糖尿病的发病机制主要为胰岛素抵抗和胰岛β细胞受损两方面，多个研究证实2型糖尿病患者的胰岛β细胞受损主要表现为数量减少和功能受损，凋亡是导致胰岛β细胞数量减少的主要原因，也因此胰岛β细胞凋亡与糖尿病的发生密切相关[8]。凋亡的调节与Bcl-2凋亡通路相关蛋白Bcl-2,Bcl-xL,Bim,Bax和Bid密切相关。研究表明，脂毒性应激可通过Bcl-2蛋白诱导胰岛β细胞凋亡[9]；Bim在胰岛素受体底物2相关基因敲除所诱导的细胞凋亡过程中发挥重要作用[10]；研究者们还发现胰岛细胞的凋亡有Bim，Puma和Bax的参与[11]。
本研究采用的实验动物KKAy小鼠具有自发糖尿病特征，表现为肥胖、多饮多食、逐渐发展为严重的糖尿病，有明显的高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗等特征。我们使用sEH抑制剂-1471干预KKAy小鼠3周，通过探索其对胰岛β细胞的保护作用，为糖尿病患者及其并发症的治疗提供思路。我们检测正常组、对照组和sEHI-1471组小鼠EETs代谢产物14,15-DHET的含量，结果提示治疗组相对于对照组，14,15-DHET含量明显减少，证实sEHI-1471已发挥作用。我们还同时发现，干预3周后sEHI-1471处理组KKAy小鼠血糖较对照组显著下降，HOMA-IR指数也随之降低，提示sEHI-1471可以改善KKAy小鼠胰岛β细胞功能。生理盐水处理组KKAy小鼠胰岛凋亡细胞明显增加，与正常组C57BL/6J小鼠有显著差异，给予sEHI-1471干预后，凋亡细胞减少，具有统计学意义。说明sEHI-1471可以抑制2型糖尿病KKAy小鼠胰岛β细胞凋亡，从而保护胰岛β细胞的分泌功能。结果还显示相对于生理盐水组，sEHI-1471作用后促凋亡蛋白Bax、Bim和Bid表达量明显减少，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表达量明显上升。说明sEHI-1471抑制KKAy小鼠胰岛β细胞凋亡的作用与促进抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表达，抑制促凋亡蛋白Bax、Bim和Bid表达相关。
综上所述，sEHI-1471通过降低胰岛细胞凋亡的发生保护胰岛细胞功能，其机制与Bcl-2家族抗凋亡蛋白表达量增加和促凋亡蛋白表达量减少相关，进一步研究在保护胰岛β细胞功能中sEHI-1471与Bcl-2家族凋亡相关蛋白的相互作用将为临床应用提供理论和实验基础。
| [1] | Kiess W, Gorski T, Penke M, et al. Diabetes mellitus in children and adolescents—a global epidemic which has become neglected[J]. J Pediatr Endocrinol Metab, 2015, 53(3-4): 247-250. |
| [2] | Kooptiwut S, Hanchang W, Semprasert N, et al. Testosterone reduces AGTR1 expression to prevent beta-cell and islet apoptosis from glucotoxicity[J]. J Endocrinol, 2015, 224(3): 215-224. DOI: 10.1530/JOE-14-0397. |
| [3] | EL-Sherbeni AA, EL-Kadi AO. The role of epoxide hydrolases in health and disease[J]. Arch Toxicol, 2014, 88(2): 2013-2032. |
| [4] | Yang L, Maki-Petaja K, Cheriyan J, et al. The role of epoxyeicosatrienoic acids in the cardiovascular system[J]. Br J Clin Pharmacol, 2015, 80(3): 28-44. |
| [5] | Motoki A, Merkel MJ, Packwood WH, et al. Soluble epoxide hydrolase inhibition and gene deletion are protective against myocardial ischemia-reperfusion injury in vivo[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2008, 295(5): 2128-2134. DOI: 10.1152/ajpheart.00428.2008. |
| [6] | Simpkins AN, Rudic RD, Roy S, et al. Soluble epoxide hydrolase inhibition modulates vascular remodeling[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2010, 298(3): 795-806. DOI: 10.1152/ajpheart.00543.2009. |
| [7] | Wang YX, Ulu A, Zhang LN, et al. Soluble epoxide hydrolase in atherosclerosis[J]. Curr Atheroscler Rep, 2010, 12(3): 174-183. DOI: 10.1007/s11883-010-0108-5. |
| [8] | Hasnain SZ, Prins JB, Mcguckin MA. Oxidative and endoplasmic reticulum stress in beta-cell dysfunction in diabetes[J]. J Mol Endocrinol, 2016, 56(2): 33-54. DOI: 10.1530/JME-15-0232. |
| [9] | Mathijs I, Da Cunha DA, Himpe E, et al. Phenylpropenoic acid glucoside augments pancreatic beta cell mass in high-fat diet-fed mice and protects beta cells from ER stress-induced apoptosis[J]. Mol Nutr Food Res, 2014, 58(10): 1980-1990. DOI: 10.1002/mnfr.v58.10. |
| [10] | Ren D, Sun J, Mao L, et al. BH3-only molecule Bim mediates beta-cell death in IRS2 deficiency[J]. Diabetes, 2014, 63(10): 3378-3387. DOI: 10.2337/db13-1814. |
| [11] | Gurzov EN, Germano CM, Cunha DA, et al. p53 up-regulated modulator of apoptosis (PUMA) activation contributes to pancreatic beta-cell apoptosis induced by proinflammatory cytokines and endoplasmic reticulum stress[J]. J Biol Chem, 2010, 285(26): 19910-19920. DOI: 10.1074/jbc.M110.122374. |