同源结构域相互作用蛋白激酶2(homeodomain-interacting protein kinase 2，HIPK2)属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族(HIPKs)，是一种参与调节细胞周期、衰老及凋亡的转录因子^[1]，主要表达于细胞核中。研究发现，HIPK2在甲状腺癌^[2]、膀胱癌^[3]及结直肠癌^[4]中表达下调，且与肿瘤转移及侵袭呈负相关，说明HIPK2可能具有抑癌作用。然而，Cheng等发现HIPK2在宫颈癌中表达增多^[5]，其表达量与宫颈癌的发展呈正相关；抑制HIPK2的表达可引起细胞凋亡增加，增殖减少，证明HIPK2在宫颈癌中可能发挥了癌基因的功能。以上研究提示HIPK2在肿瘤中的作用尚无定论，它在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)中的表达情况及其对预后的影响尚不清楚。本文通过研究HIPK2在OSCC组织及细胞中的表达，探讨其在OSCC中的作用，为OSCC的预后评估提供参考。

组织芯片样本来源于武汉大学口腔医院2002年1月至2009年2月经手术切除并确诊的OSCC石蜡标本99例(其中20例伴颈淋巴结转移)。

在每例标本HE切片上标记癌旁正常上皮、肿瘤中心和肿瘤前沿三个部位(伴淋巴结转移者还包括淋巴结转移灶)并在供体蜡块的对应部位作标记，设计好阵列图，送往上海芯超生物有限公司制成组织芯片。

组织切片60 ℃烘烤1 h，使用AutostainerLink 48(Dako)进行脱蜡、梯度乙醇溶液水化及抗原修复，HIPK2抗体(兔抗，Sigma)室温孵育1 h，再使用AutostainerLink进行过氧化物阻断、二抗孵育及DAB染色。

OSCC细胞系(包括Cal27、SCC9及SCC25)常规培养于含10%FBS(Hyclone)的DMEM或DME/F12培养基中，正常上皮细胞系(HIOEC)常规培养于KBM(Lonza)培养基中，37 ℃、5%CO₂恒温培养。

提取细胞总RNA(Omega总RNA提取试剂盒)，以总RNA为模板进行逆转录合成cDNA(Takara逆转录试剂盒)，再进行real-time PCR反应(Roche，FastStart Essential DNA Green Master)。以β-actin为内参，使用2^-ΔΔCt法对目的基因进行分析。引物序列如下：

β-actin Forward 5′-ACCAACTGGGACGACATGGAGAAA-3′；

Reverse 5′-TAGCACAGCCTGGATAGCAA CGTA-3′；

HIPK2 Forward 5′-CCCCGTGTACGAAGGTATGG-3′；

Reverse 5′-GGGATGTTCTTGCTCTGGCT-3′。

贴壁培养的细胞用4%多聚甲醛固定15 min，1%Triton破膜15 min，4%BSA室温封闭30 min，滴加HIPK2抗体(兔抗，Abcam)4 ℃孵育过夜；用PBS浸洗3次，5 min/次，用标记有Cy3的二抗37 ℃避光孵育1 h，PBS浸洗3次，5 min/次。滴加DAPI复染核5 min，蒸馏水浸洗3次，5 min/次，共聚焦显微镜下观察。使用Image-Pro Plus软件分析细胞免疫荧光结果，以细胞的平均荧光强度(IOD)代表蛋白表达密度。

免疫组化染色结果使用Aperio ImageScope v11.2.0进行分析。染色阳性结果计算公式：(强阳性细胞数×3+阳性细胞数×2+弱阳性细胞数×1)/染色面积。每一个阵点随机选取4个视野，取平均值。数据以均数±标准差表示，使用GraphPad Prism 5进行统计分析。计数资料采用Fisher检验，组间的两两比较采用t检验，多组间的比较采用ANOVA检验，并使用log-rank检验进行生存分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

免疫组化染色结果显示，99例OSCC组织的癌旁正常上皮、肿瘤中心、肿瘤前沿及转移淋巴结均表现为HIPK2染色阳性(图 1)。ImageScope软件分析显示，癌旁正常上皮的平均光密度为748.75±755.90，肿瘤中心、肿瘤前沿及转移淋巴结的平均光密度分别为2 843.32±1 328.16、2 920.28±1 318.18及1 274.15±454.87，分别是癌旁正常上皮的3.80倍、3.90倍及1.70倍，差异具有统计学意义(P＜0.05)(图 2A)。其中，肿瘤原发灶不伴淋巴结转移的平均光密度(3 174.96±1 305.54)是伴淋巴结转移(1 533.35±1 446.63)的2.07倍，差异具有统计学意义(P=0.000 6)(图 2B)。

图 1(Figure 1)

图 1 HIPK2在OSCC组织芯片中的代表性病例(×500) A：免疫组化结果显示HIPK2在癌旁正常上皮中的阳性染色比肿瘤中心、肿瘤前沿及淋巴结转移灶浅；B：99例OSCC组织芯片免疫组化染色结果的聚类关系

图 2(Figure 2)

图 2 HIPK2在肿瘤不同部位及是否伴淋巴结转移表达的差异 A：癌旁正常上皮、肿瘤中心、肿瘤前沿及淋巴结的平均光密度值比较，肿瘤中心、肿瘤前沿及淋巴结的平均光密度比癌旁正常上皮显著升高(P＜0.05)；B：肿瘤中心伴淋巴结转移及不伴淋巴结转移的平均光密度值比较，有转移比无转移低(P<0.000 1)

免疫组化染色结果显示，HIPK2在OSCC组织中表现出胞核阳性、胞核及胞质均阳性及仅胞质阳性3种表达模式。癌旁正常上皮主要表现为胞核阳性，肿瘤中心主要表现为胞核及胞质均阳性或仅胞质阳性(图 3)。HIPK2在OSCC肿瘤中心以仅胞质阳性表达模式为主(61/99)，占61.62%。

图 3(Figure 3)

图 3 HIPK2在OSCC组织中的不同表达模式 A：病例1中癌旁正常上皮为胞核阳性，肿瘤中心为胞核及胞质均阳性；B：病例2中癌旁正常上皮为胞核阳性，肿瘤中心为仅胞质阳性

通过分析99位OSCC患者的临床病理资料与HIPK2表达的关系，我们发现HIPK2的表达模式与患者临床分期及病理分级显著相关(P＜0.01)，而与性别及年龄无显著相关性(P＞0.05)(表 1)。其中，临床分期Ⅰ+Ⅱ期病例中仅胞质阳性的例数显著少于Ⅲ+Ⅳ期病例(P=0.004 1)；病理分级Ⅰ+Ⅱ级病例中仅胞质阳性的例数显著少于Ⅲ级病例(P=0.000 7)。

表 1(Table 1)

表 1 HIPK2的表达与临床病理因素间的关系[Fisher精确检验, n(%)] 项目 例数 胞质表达 胞核及胞质表达 P 性别  男 59 37(62.7) 22(37.3) 0.835 0  女 40 24(60.6) 16(40.0) 年龄(岁)  ＜60 62 40(64.5) 22(35.5) 0.523 2  ≥60 37 21(56.8) 16(43.2) 临床分期  Ⅰ-Ⅱ 52 25(48.1) 27(51.9) 0.004 1**  Ⅲ-Ⅳ 47 36(76.6) 11(23.4) 病理分级  Ⅰ+Ⅱ 85 47(55.3) 38(44.7) 0.000 7***  Ⅲ 14 14(100.0) 0(0.0)

表 1 HIPK2的表达与临床病理因素间的关系[Fisher精确检验, n(%)]

99位OSCC患者死亡36例，生存60例，失访3例，总体生存率为60.61%，随访时间为60-111个月。通过log-rank检验对肿瘤中心不同表达模式的患者进行生存分析，结果显示胞核及胞质均阳性、仅胞质阳性相对较强、仅胞质阳性相对较弱者的总体生存率依次降低(P=0.000 6)，仅胞质阳性相对较弱者的总体生存率最低(图 4)。

图 4(Figure 4)

图 4 肿瘤中HIPK2的表达模式与预后的关系 胞核及胞质均阳性、仅胞质阳性相对较强、仅胞质阳性相对较弱者的总体生存率依次降低(P=0.000 6)，仅胞质阳性相对较弱者的总体生存率最低

Real-time PCR结果显示，与HIOEC相比，HIPK2在Cal27、SCC9及SCC25细胞中mRNA的表达分别升高了1.71倍、10.40倍及3.00倍，差异具有统计学意义(P＜0.01)(图 5C)。细胞免疫荧光结果显示，HIPK2在HIOEC、Cal27、SCC9及SCC25细胞中的IOD分别为151.03±39.12、165.31±37.69、571.17±105.08及490.02±76.24，HIPK2在SCC9及SCC25细胞中蛋白的表达显著升高(P＜0.001)(图 5A，图 5B)。其中，HIPK2在HIOEC及Cal27细胞中主要表达于胞核，仅少量表达于胞质中；在SCC9及SCC25细胞中胞核及胞质均有表达。

图 5(Figure 5)

图 5 HIPK2在OSCC细胞系中的表达 A：细胞免疫荧光实验显示HIPK2在4种细胞系(HIOEC、Cal27、SCC9及SCC25)中蛋白的表达(×1 000)；B：HIPK2在SCC9及SCC25细胞中蛋白的表达显著高于HIOEC(P＜0.001)；C：Real-time PCR检测HIPK2在4种细胞系中mRNA的表达，在Cal27、SCC9及SCC25细胞中mRNA的表达显著高于HIOEC(P＜0.01)

HIPK2是HIPKs家族的主要成员，可被紫外线、电离辐射及化疗药物等DNA损伤刺激激活^[1]。研究显示，激活的HIPK2可以通过p53依赖或非p53依赖的方式激活细胞凋亡^[1]，还可以参与p53^[6]及Wnt信号通路^[7]影响细胞增殖，发挥抑癌功能。研究报道HIPK2在甲状腺癌^[2]、膀胱癌^[3]及结直肠癌^[4]中表达减少，并抑制细胞凋亡。其表达下调还与肿瘤转移及侵袭呈负相关，说明HIPK2可能抑制了肿瘤的发展。然而，也有研究发现HIPK2在多种肿瘤中表达上调并发挥了促癌作用，提示HIPK2在肿瘤中的作用尚存争议，值得探讨。

本研究结果显示，HIPK2在OSCC肿瘤中表达显著升高，说明它在OSCC中可能起到了促癌作用。据文献报道，HIPK2在上皮鳞状细胞癌、基底细胞癌^[8]及宫颈癌^[5]中表达也明显上调，其在宫颈癌中的表达量还与宫颈癌的发展呈正相关，证明HIPK2在其他肿瘤中也可能具有癌基因的功能。研究表明，在正常状态下HIPK2主要表达于细胞核核斑内，容易被蛋白酶降解而保持较低水平。在基础活性氧水平下，HIPK2通过类泛素化修饰并结合组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)，限制细胞的增殖及分化^[9]；然而，在中度水平的活性氧刺激下，HIPK2的类泛素化修饰被乙酰化代替，HIPK2从核斑转位至核浆及胞质，帮助癌细胞逃避死亡^[10]，促使肿瘤生存；在超过耐受阈值的活性氧刺激下，HIPK2的乙酰化被阻断，HIPK2可逃避蛋白酶降解保持较高水平，并可冲破细胞自身的保护机制^[11]，造成细胞凋亡^[9]。以上研究说明在一定程度肿瘤环境刺激下，HIPK2具有促癌功能，其表达量及表达模式可以反映肿瘤的进展情况，可能是评估肿瘤进展的新靶点。

本研究还发现HIPK2具有胞核表达、胞核及胞质均表达及仅胞质表达3种表达模式，在OSCC肿瘤中主要表现为胞核及胞质均阳性或仅胞质阳性，并以仅胞质阳性为主。HIPK2的这种表达模式还与患者的预后相关，仅胞质阳性相对较弱者预后最差。此研究结果证实了HIPK2的胞质再定位与肿瘤预后密切相关。研究表明，影响HIPK2胞质再定位的因素主要有两个，一是基因突变，例如，Lys798突变可使HIPK2弥散表达于整个细胞质中^[12]；Arg826及Tyr361F突变可显著减少HIPK2在细胞核内的表达^{[12, 13]}。二是蛋白翻译后修饰，如HIPK2乙酰化后表达于细胞核核浆及细胞质中^{[9, 10]}；HIPK2磷酸化后表达于细胞质中^[14]。此外，酪氨酸自主磷酸化^{[15, 16]}及热激^[17]也可以影响HIPK2的胞质再定位。HIPK2向核浆甚至胞质中的转位相应地改变了其功能^[10]，不但可以引起多种氧化还原调节基因的转录抑制^[9]，还可以影响蛋白-蛋白间的相互作用及信号传递^[12]，但影响肿瘤预后的具体机制尚不明确，有待进一步深入研究。

总之，本研究发现HIPK2在OSCC中表达升高，且以仅胞质阳性表达为主。HIPK2的表达及胞质再定位与OSCC的预后密切相关，但其具体机制尚不清楚，有待进一步探索。