武汉大学学报(医学版)   2017, Vol. 38Issue (3): 357-360   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.03.004.
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引用本文 

麻志恒, 钟利平, 余柯娜, 何立群. 抗纤灵对慢性肾功能衰竭小鼠模型肾组织相关炎症因子的干预作用[J]. 武汉大学学报(医学版), 2017, 38(3): 357-360. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.03.004.
MA Zhiheng, ZHONG Liping, YU Kena, HE Liqun. Effects of Kangxianling Decoction on Kidney Tissue Inflammatory Cytokines in Chronic Renal Failure Mice[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2017, 38(3): 357-360. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2017.03.004.

作者简介

麻志恒，男，1976-，医学博士，副主任医师，主要从事中西医防治肾脏病的临床及实验研究

基金项目

国家自然基金面上项目 (编号：81373615)

通讯作者

何立群，男，1959-，医学博士，教授，主要从事肾脏病的基础及临床研究

文章历史

收稿日期：2015-09-09
Contents              Abstract             Full text              Figures/Tables              PDF
抗纤灵对慢性肾功能衰竭小鼠模型肾组织相关炎症因子的干预作用
麻志恒 1,2, 钟利平 1, 余柯娜 1, 何立群 1     
1. 上海中医药大学附属曙光医院肾病科 上海 201203;
2. 上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院中医内科 上海 202150
收稿日期：2015-09-09
基金项目：国家自然基金面上项目 (编号：81373615)
作者简介：麻志恒，男，1976-，医学博士，副主任医师，主要从事中西医防治肾脏病的临床及实验研究
通讯作者：何立群，男，1959-，医学博士，教授，主要从事肾脏病的基础及临床研究
[摘要] 目的: 观察抗纤灵对小鼠慢性肾功能衰竭 (CRF) 模型肾组织相关炎症因子的干预作用。 方法: 将40只C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、模型组、雷帕霉素组和抗纤灵组，每组10只，除假手术组仅分离肾组织外，其他各组采用Platt 5/6肾切除方法制备CRF模型，雷帕霉素组、抗纤灵组分别予雷帕霉素、抗纤灵水煎剂，假手术组及模型组予等量生理盐水灌胃，疗程8周。免疫组化法检测肾组织中F4/80细胞的表达，RT-PCR法检测肾组织基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9) mRNA的表达，ELISA法检测大鼠肾组织白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 水平。 结果: 与假手术组比较，模型组小鼠肾组织F4/80阳性细胞，MMP-2、MMP-9 mRNA水平明显升高，IL-6、TNF-α含量明显增加 (P < 0.01)；与模型组比较，雷帕霉素、抗纤灵组F4/80阳性细胞减少，MMP-2、MMP-9 mRNA水平下降，IL-6、TNF-α含量降低 (P＜0.05或P < 0.01)；雷帕霉素和抗纤灵组比较，两组无显著性差异 (P>0.05)。 结论: 抗纤灵能够减轻CRF小鼠肾组织的炎症反应，抑制肾脏纤维化。
关键词： 慢性肾功能衰竭    炎症    肾纤维化    抗纤灵    
Effects of Kangxianling Decoction on Kidney Tissue Inflammatory Cytokines in Chronic Renal Failure Mice
MA Zhiheng1,2, ZHONG Liping1, YU Kena1, HE Liqun1     
1. Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China;
2. Xinhua Hospital Chongming Branch Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 202150, China
[Abstract] Objective: To observe the effects of Kangxianling Decoction (KXLD) on kidney tissue inflammatory cytokines in chronic renal failure (CRF) mice. Methods: Forty 57BL/6J mice were randomly divided into sham group, model group, rapamycin (RAP) group and KXLD group as 10 mice in each group. Except sham group, other groups were established CRF by Platt 5/6 nephrectomy.Then, equal volume of rapamycin (0.13 mg/100 g), KXLD (2 g/100 g) and saline was respectively given to mice in the RAP group, KXLD group, normal group and model group, for 8 weeks. The mice were sacrificed and renal tissue was collected to observe the F4/80 positive cells by immunohistochemical, the level of MMP-2 and MMP-9 mRNA expression by RT-PCR and the contents of kidney tissue inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α by ELISA were detected respectively. Results: the number of positive F4/80 cells, the level of MMP-2, MMP-9 mRNA expression and production of IL-6 and TNF-α in model group increased significantly compared with the sham group (P < 0.01). However, compared with the model group, the number of positive F4/80 cells, the level of MMP-2 and MMP-9 mRNA expression and secretion of IL-6 and TNF-α obviously decreased in RAP and KXLD group (P < 0.05 or P < 0.01). While there was no statistical difference between RAP and KXLD groups (P>0.05). Conclusion: KXLD, similar to RAP, may reduce kidney tissue inflammatory reaction in chronic renal failure mice and inhibit renal fibrosis.
Key words: Chronic Renal Failure    Inflammation    Renal Fibrosis    Kangxianling Decoction    

微炎症状态在慢性肾功能衰竭 (chronic ronal failure, CRF) 进展中起着重要作用[1]，抗纤灵汤剂经前期临床及动物实验，发现其具有降低患者蛋白尿，改善肾功能作用，同时对大鼠CRF模型的纤维化指标、炎症指标都具有较好的改善作用[2-5]。因此，笔者采用5/6肾切除方法制备小鼠CRF模型，并以雷帕霉素作对照，观察抗纤灵对模型小鼠肾组织相关炎症因子的影响，旨在丰富抗纤灵治疗肾脏纤维化的作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物

清洁级C57BL/6J小鼠40只，体重18-22 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供[许可证号：SCXK (沪)2008-0016]，饲养于上海中医药大学实验动物中心，予12 h光照，45 ℃湿度环境中，自由饮水，进食，适应1周后进行实验。

1.1.2 药物

抗纤灵由丹参15 g，桃仁12 g，当归12 g，怀牛膝15 g，酒大黄9 g组成，购于上海曙光医院中药房，煎煮20 min；雷帕霉素粉剂10 mg，上海威奥生物公司提供，批号：R706203。

1.1.3 主要试剂、抗体及仪器

Trizol Reagent RNA抽提试剂盒 (Invitrogen公司)；逆转录试剂盒Prime Script RT reagent Kit (TaKaRa公司)；实时荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa公司)；F4/80、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9) 抗体 (美国Abcam公司)；GAPDH抗体 (Santa Cruz公司)；二抗HRP标记的IgG (上海威奥生物公司)；两步法免疫组化试剂盒 (武汉博士德公司)。5417R型高速低温离心机 (德国Eppendorf公司), ELX800型酶标仪 (美国Bio-Tek公司)，Mini Protean Cell小型垂直电泳电泳槽 (美国Bio-Rad公司)，CFX-96荧光定量PCR仪 (美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法 1.2.1 造模及分组

40只小鼠分为假手术组10只和造模组30只，参考文献[6]方法，应用Platt 5/6肾切除方法制备小鼠CRF模型，造模2周后根据血肌酐值，将造模组小鼠分层并随机分为模型组、雷帕霉素组和抗纤灵组，每组10只，使各组肌酐组间比较无显著性差异，假手术组仅剥离肾组织。

1.2.2 给药

术后雷帕霉素组、抗纤灵组分别予雷帕霉素 (0.13 mg/100 g)，抗纤灵水煎剂 (2 g/100 g) 灌胃，假手术组及模型组予等量生理盐水，疗程均为8周，8周后处死动物，取残余肾组织备检。

1.2.3 肾组织F4/80表达的检测

采用免疫组织化学法，石蜡切片脱蜡至水，3% H2O2灭活，微波热修复抗原，冷却后PBS洗涤，5% BSA封闭，滴加兔抗鼠F4/80(1:50)，4 ℃孵育过夜，滴加二抗羊抗兔IgG后，37 ℃孵育0.5 h，PBS冲洗，滴加DAB显色，苏木素复染，分化，脱水，透明，封片，镜检。以PBS代替一抗作为阴性对照, 阳性染色为棕黄色，光学显微镜×400摄取图像，每组随机选取6个标本，每个标本随机选取5个不重复视野进行拍摄并计算阳性细胞个数。

1.2.4 肾组织中MMP-2，MMP-9 mRNA相对表达测定

Trizol法提取肾脏总组织RNA，按照逆转录试剂盒反转录cDNA，总反应体系为20 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA2 μl，两步法PCR扩增条件：95 ℃、30 s变性；95 ℃、5 s, 60 ℃、31 s, 40个循环。以双蒸水代替cDNA模板作阴性对照, 以GAPDH为内参照基因。相对MMP-2，MMP-9 mRNA表达以2-(靶基因Ct值-GAPDH Ct值) 表示，基因引物序列分别为：

MMP-2上游AGGGCACCTCTTACAACAGC, 下游CCCGGTCATAATCCTCGGGGTG;

MMP-9:上游AGGGGGCTCTGCATTTCTTC, 下游CTGCAATTGGCTTCCTCCGT；

GAPDH:上游GACGGCAAGTTCAAGGGCACAGTCA, 下游GTGAAGACGCCAGTAGACTCTCCAC。

1.2.5 肾组织白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 含量测定

ELISA方法检测小鼠肾组织IL-6、TNF-α含量，将肾组织称重、剪碎，用生理盐水 (含抑肽酶) 匀浆，制成10%浓度的组织匀浆液，3 000 r/min离心15 min，取上清液，按照说明书检测其含量。

1.2.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行分析。所有数据均以x±s表示，组间比较采用方差分析，方差齐采用LSD法, 方差不齐采用Dunnett's T3法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 抗纤灵对各组小鼠肾组织光镜下F4/80免疫组化染色的影响

光镜下观察，假手术组可见少许的染色为棕褐色的F4/80细胞，模型组F4/80阳性细胞明显增多，经雷帕霉素、抗纤灵药物治疗后，两组的阳性细胞明显减少。见图 1。

图 1 各组小鼠肾组织F4/80阳性细胞的表达 A.假手术组; B.模型组; C.雷帕霉素组; D.抗纤灵组
2.2 抗纤灵对各组小鼠肾组织F4/80阳性细胞计数的影响

与假手术组比较，模型组F4/80阳性细胞计数显著升高 (P＜0.01)；与模型组比较，雷帕霉素组、抗纤灵组F4/80阳性细胞计数显著下降 (P＜0.01)，雷帕霉素与抗纤灵比较，两组之间无显著性差异 (P>0.05)。见表 1。

表 1 各组小鼠肾组织F4/80阳性细胞计数比较 (n=6)
2.3 抗纤灵对各组小鼠肾组织MMP-2、MMP-9 mRNA相对含量表达的影响

与假手术组比较，模型组MMP-2、MMP-9 m RNA表达明显升高 (P＜0.01)；与模型组比较，雷帕霉素、抗纤灵组MMP-2、MMP-9 mRNA明显下降 (P＜0.05)；雷帕霉素与抗纤灵组比较，无显著性差异 (P>0.05)。见表 2。

表 2 各组小鼠肾脏组织中MMP-2、MMP-9 mRNA相对表达含量的比较 (x±s)
2.4 抗纤灵对各组小鼠肾组织IL-6、TNF-α含量的影响

与假手术组比较，模型组肾组织IL-6、TNF-α含量明显升高 (P＜0.01)；与模型组比较，雷帕霉素、抗纤灵组IL-6、TNF-α含量均有所降低 (P＜0.05)；雷帕霉素组与抗纤灵组比较，无显著性差异 (P>0.05)。见表 3。

表 3 各组小鼠肾组织中IL-6、TNF-α含量的比较 (x±s，ng/L)
3 讨论

肾脏纤维化是指各种原因导致的慢性肾损伤之后，肾组织的修复过程，主要表现为炎症细胞募集和其后诱发的炎症级联反应，肌成纤维细胞激活和再生，细胞外基质的过度形成和沉积等。参与肾纤维化的因素种类繁多，其中炎症是纤维化的始发因素，炎症细胞，特别是单核-巨噬细胞，淋巴细胞等细胞因子，能够激活体内单核巨噬系统，释放以IL-6和TNF-α含量为主的早期炎性介质，募集肌成纤维细胞聚集，导致肾脏纤维化的发生。其中IL-6、TNF-α为大家熟知的炎症因子，这些炎症因子的释放能够进一步促进MMP-2，MMP-9等的过度表达，最终导致细胞外基质的生成和溶解发生失衡，引起肾脏纤维化的发生[7]。研究也表明，巨噬细胞参与了肾脏纤维化的形成，而F4/80为巨噬细胞的主要标志物，近年来成为观察肾脏纤维化的主要指标之一[8, 9]。

雷帕霉素作为一种免疫抑制剂，能够抑制白细胞的活性，阻止由细胞因子IL-1、2、4、5、6等引起的T细胞增生和剂量依赖性的有丝分裂[10]，具有减少蛋白尿，减轻肾小管间质纤维化，保护足细胞等作用[11]。同时具有降低成纤维细胞在病灶内的聚集和表型转化[12]，抑制TNF-α促炎作用，调控Akt/mTOR通道, 增强TNF-α诱导不典型增生细胞凋亡，还可通过调节免疫，上调抑炎因子IL-10的表达, 减低促炎因子IL-6的表达[13]，进而能够抑制炎症反应。

我们认为慢性肾脏纤维化的中医病机为肾虚血瘀，故治疗应以活血化瘀，补肾通络为原则，经过前期不断的筛选和优化经验方的组成，最终形成抗纤灵方，结果显示, 其能够减低模型小鼠肾组织F4/80阳性细胞的表达，降低MMP-2、MMP-9水平和IL-6、TNF-α含量 (P＜0.05)，作用和雷帕霉素相近，因此我们推测抗纤灵可能具有减轻CRF小鼠肾组织的炎症反应，抑制肾组织纤维化作用，作用机制可能与雷帕霉素类似。

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