颞叶癫痫(temporal lope epilepsy,TLE)的发作与海马等边缘系统的病变密切相关，海马对缺血有选择性敏感，影响血供的很多疾病，均可能损伤海马内的神经组织^[1]。研究表明血脑屏障破坏参与了癫痫的发病 ^{[2, 3]}。血脑屏障(blood brain barrier，BBB)的破坏是早期脑缺血的重要组成部分，其早期功能障碍促进了脑水肿的发生。促血管生成素(angiopoietin，Ang)-1可以对抗由血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)所引发的血管渗透性增加^[4]，Ang-1和VEGF的平衡对于维持中枢神经BBB的完整性起关键作用。

我们将在本课题中研究Ang-1、VEGF在大鼠颞叶癫痫痫性发作的作用，观察动物行为学改变，比较实验组和对照组海马组织Ang-1、VEGF的动态表达，探讨癫痫的发病机制，为研发更好的癫痫治疗药物提供理论依据。

健康雄性Wistar大鼠(湖北省疾病控制中心，动物编号06072A)45只,8-12周龄，体重270-330 g；精神活泼，反应灵敏，体形正常，毛色光泽。

氯化锂、匹罗卡品、阿托品、水合氯醛、丙烯酰胺、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PVDF膜、GAPDH抗体、Ang-1、VEGF、HRP标记羊抗兔二抗、微量移液器(Eppendorf)、电泳仪电源、垂直电泳槽、电转仪、水平摇床、电子天平。

健康清洁级雄性Wistar大鼠60只，饲养于武汉大学人民医院动物实验室。将大鼠随机分为 3组：①空白对照组 15只，仅腹腔注射生理盐水；②氯化锂-匹罗卡品模型组45只：先注射氯化锂(10 mg/kg)，20-24 h后注射注射匹罗卡品(20 mg/kg)，20 min内如未发生抽搐症状，20 min后重复注射匹罗卡品(10 mg/kg)，重复注射不得超过3次。匹罗卡品处理前 30 min给予皮下注射阿托品(1 mg/kg)。观察大鼠的行为学改变，根据Racine分级评价标准^[1]分级：Ⅰ级为面部阵挛；Ⅱ级为节律性点头发作；Ⅲ级为单侧前肢抽搐；Ⅳ级为双前肢抽搐；Ⅴ级为四肢抽搐或失去平衡、跳跃并跌倒等。发作级别达Ⅳ级及以上，持续抽搐超过半小时者给予10%水合氯醛(4 ml/kg)终止。发作级别达Ⅳ级及以上的存活大鼠为实验组A，发作级别为Ⅰ级以上及Ⅳ级以下的存活大鼠为实验组B。选取注射匹罗卡品(或生理盐水)后12 h、1 d、3 d、13 d、18 d这5个时间点。

注射匹罗卡品(或生理盐水)后12 h、1 d、3 d、13 d、18 d这5个时间点,根据存活大鼠数量均衡处死一定数量大鼠：使用 10％水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉，使用75％乙醇消毒后断头，暴露颅骨，剥离颅骨并取出海马组织，以上操作均在冰上进行。

提取海马区总蛋白，BCA 法标准曲线测定蛋白含量，通过 SDS-PAGE 电泳，半干转膜，封闭，一抗、二抗孵育，成像，图片扫描后应用Image-Pro Plus Version 6.0 图像分析软件对蛋白免疫印迹灰度值进行定量分析。 采用目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值表示其蛋白质相对表达水平。

使用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。所有呈正态分布的计量资料均以均数±标准差( x±s )表示，两组计量资料间比较采用独立样本均数t检验；以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

实验组大鼠有以下行为学改变：

(1) 急性期：癫痫模型组大鼠匹罗卡品经腹腔注射，一般在半小时左右出现洗脸样动作，面部抽动，口角咀嚼样动作，凝视或者头摆，不自主运动，流涎，血泪等，这些为癫痫发作的早期表现。给药后大概 30 min以后部分大鼠出现肢体阵挛、肌肉强直、不自主站立并因为失去平衡而跌倒等。发作半小时后给予 10％水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射以中止发作。按Racine 分级标准发作达Ⅳ级及以上可列为实验组，在癫痫模型组中有 28只(62％)满足要求归入实验组，有12只(26.7％)没有达到要求被排除实验组，有2只(4.4％)注药后持续抽搐死亡，3只 (6.7%)于注药后3 d内死亡(如表 1)。此期实验组大鼠精神、食欲较差、活动明显减少。

表 1(Table 1)

表 1 实验组与对照组大鼠的行为学改变 组别 Ⅲ级及以下 Ⅳ级及以上 3 d内死亡 存活无抽搐 总数 实验组 5 28 5 7 45 对照组 0 0 0 15 15

表 1 实验组与对照组大鼠的行为学改变

(2) 静止期：平均静止期为(9.7±2.2) d，此期内未观察到任何痫性发作迹象，个别大鼠表情较为迟钝。

(3) 慢性期：可观察到自发痫性发作，每周有1-3次Ⅰ-Ⅴ级不同形式的自发痫性发作，表现与急性期类似，但持续时间较短暂，每次为1 min左右，可自行停止。慢性期癫痫大鼠对外界刺激较敏感、易激惹，未发作时精神食欲可接近正常大鼠。

第12小时，Ang-1表达较正常值减少(P＜0.05)，后持续下降，至第3天降至最低水平，第13天升高(P＜0.05)，至第18天接近正常水平(P＜0.05)；对照组Ang-1表达随时间表达无显著性差异(表 2)。

表 2(Table 2)

表 2 各组大鼠Ang-1随时间的动态表达过程 组别 12 h 1 d 3 d 13 d 18 d 实验组 0.416±0.020△* 0.358±0.183△* 0.262±0.013△ 0.395±0.017* 0.408±0.195* 对照组 0.406±0.109 0.408±0.107 0.407±0.106 0.407±0.010 0.406±0.101 与对照组相比，△P＜0.05；与第3天相比，*P＜0.05

表 2 各组大鼠Ang-1随时间的动态表达过程

第12小时，VEGF蛋白表达较正常值增加(P＜0.05)，后持续下降，至第3天降至最低水平，第13天升高(P＜0.05)，至第18天接近正常水平(P＜0.05)(表 3)。

表 3(Table 3)

表 3 各组大鼠VEGF蛋白表达随时间的动态过程 组别 12 h 1 d 3 d 13 d 18 d 实验组 0.571±0.016△* 0.760±0.018△* 0.873±0.012△ 0.59±0.017△* 0.326±0.014* 对照组 0.339±0.120 0.340±0.110 0.350±0.106 0.338±0.090 0.337±0.111 与对照组相比，△P＜0.05；与第3天相比，*P＜0.05

表 3 各组大鼠VEGF蛋白表达随时间的动态过程

图 1(Figure 1)

图 1 实验组Ang-1随时间的动态表达

图 2(Figure 2)

图 2 实验组VEGF随时间的动态表达

在正常生理状况下,BBB 使脑组织与血液循环的某些物质和免疫系统相隔离,对脑组织具有保护作用。微血管作为BBB的重要组成部分，其形态功能改变都有可能增加BBB的通透性。van Vliet等^[5]发现颞叶癫痫患者海马区有大量清蛋白在血管外沉积，且癫痫发作次数与BBB通透性成正相关性。

研究表明BBB渗漏出现在癫痫发作数分钟后，并可持续数小时至数天 ^{[5, 10]}。本实验中，癫痫大鼠海马急性期有Ang-1的降低，这可能由于药物导致Ang-1表达减少，引起BBB通透性增加，从而影响了海马区血液的供应及炎性因子渗漏增加，导致癫痫反复发作。脑缺血再灌注后Ang-1表达增加，与Tie-2 结合，可以抑制脑微血管内皮细胞凋亡，减轻VEGF引起的血管通透性增高，降低脑水肿的程度^[5]；使用转染Ang-1的间充质干细胞治疗脑缺血缺氧性脑病，血管的结构和功能较对照组都有显著的改善^[6]。

正常情况下,血管内皮细胞表达极低水平的VEGF,仅在活化的内皮细胞上高表达。VEGF可破坏血管壁的基质成分，使血管内皮细胞通透性增高，缺氧和血液切变应力的改变可促进VEGF表达 ^{[7, 8]}。VEGF可以在脑缺血后加重BBB的渗出,诱发血管源性脑水肿甚至脑出血,从而阻塞微血管管腔而减少血供,最终引起颅内压的增高。实验中VEGF表达在癫痫发作急性期初期增高，这可能与癫痫发作引起的脑部缺血缺氧诱导所致，亦可能与匹罗卡品诱导VEGF表达增加，从而使BBB破坏增加，BBB通透性增强，促使损伤因子进入到脑部，造成脑部损害，导致癫痫的反复发生，后者又导致VEGF的表达增加。当血管微环境中VEGF含量升高时,Ang-2/Tie-2竞争抑制Ang-1/Tie-2的血管结构稳定作用,促进血管基底膜裂解,并强化内皮细胞对VEGF的敏感性,最终形成新的毛细血管 ^{[10, 11]}。癫痫发作经历了短暂的静止期，发作后第13天，发现Ang-1的表达增高，VEGF表达降低，既可促使新生血管的产生，又减少血管渗漏，从而使BBB通透性减低，也有助于营养物质的输送，使脑部功能逐渐恢复至正常，癫痫发作逐渐减少。在慢性期，大鼠仍有抽搐发作，这可能与神经细胞损伤的不可逆性有关,本实验亦有局限，后期研究中可用Ang-1对部分癫痫大鼠进行干预，与未干预组比较癫痫发作的改变情况。

综上所述，癫痫大鼠海马区急性期Ang-1低表达，VEGF高表达，慢性期Ang-2表达逐渐升至正常水平，VEGF呈降低趋势，且二者与时间呈动态相关，与癫痫发作可能有一定的关系，但促进Ang-1高表达是否对癫痫有治疗作用还有待进一步研究。