糖尿病发病率日益增加，研究证明糖尿病患者存在认知功能损害^[1]。认知功能损害表现为学习和记忆功能受损，以及视空能力受损和执行决策功能障碍，影响老年人的晚年生活质量。

CYP1B1是细胞色素酶P450(cytochrome P450, CYP) 蛋白中的一员，CYP家族和认知功能的关系也得到部分研究的证实，例如CYPs代谢睾丸激素和雌二醇，此物质属于神经活性类固醇，对认知和记忆有影响；当敲除小鼠脑专属的CYP46A1基因时，会降低脑内的胆固醇水平，并且在人体中CYP46A1的多态性与认知损害有一定的联系^[2]。我们实验室前期研究表明，CYP1B1在脂肪代谢中起作用，并抑制高脂膳食诱导的脂肪组织炎症^[3]，且CYP1B1对高脂膳食诱导的认知损伤有调控作用，而这种调控作用与氧化应激有关^[4]。因此，结合相关文献研究和前期结果，本实验采用高脂高糖饲料加低剂量链脲佐菌素建立 (Streptozcin, STZ) 小鼠2型糖尿病，探讨CYP1B1敲除对改善小鼠2型糖尿病导致的认知功能损害的影响，和对小鼠的学习记忆能力的保护作用。

链脲佐菌素 (Sigma公司)，血糖测试仪和血糖试纸 (Johnson One touch Ultra)，柠檬酸和柠檬酸三钠 (上海生物工程)，Morris水迷宫 (上海移数信息科技有限公司)，计算机 (联想Intel P4兼容机)，图像采集系统 (包括摄像机、图像采集卡、广角变焦镜头)，Morris水迷宫数据采集和分析软件，脱脂奶粉 (武汉洁洋盛)，避暗机器 (北京亚欧德鹏)。

CYP1B1基因敲除 (KO) 小鼠 (美国Frank Gonzalez博士赠送)，SPF级C57BL/6J野生型 (WT) 小鼠 (武汉大学实验动物中心提供)。

清洁级高脂高糖饲料 (上海普路腾生物科技有限公司提供)，普通饲料 (湖北省疾病预防控制中心动物实验中心提供)。高脂高糖饲料的供能比例为：29.23%脂肪、52.04%碳水化合物和18.73%蛋白质，普通饲料的供能比例为：4.14%脂肪、75.52%碳水化合物和20.34%蛋白质。

20-22 g野生型 (WT) 和CYP1B1基因敲除 (KO) 雄性小鼠，随机分为高脂高糖膳食组 (high fat-high sucrose diet，HFSD) 和对照普通膳食组 (normal chew, NC)，即WT-NC组、KO-NC组、WT-HFSD组和KO-HFSD组, 每组7只。3周相应饲料喂养后，在第3周末, 禁食8 h，测其空腹血糖后，取50 mg STZ溶于10 ml的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液 (由0.1 mol/L柠檬酸钠和0.1 mol/L柠檬酸按照1:1.32配制, pH 4.5) 中, HFSD组腹腔注射STZ 100 mg/kg，NC组注射相应溶剂作为对照，继续喂养3周后在第6周末, 小鼠禁食不禁水8 h后, 用血糖仪测定血糖。小鼠2型糖尿病成模标准:空腹血糖≥11.1 mmol/L且多饮、多尿、多食、体重增加不明显，保持充足食物和水，每天更换垫料。成模后进行Morris水迷宫实验和避暗实验，检测各组小鼠的学习记忆能力。

定位航行实验 (place navigation test, PNT) 在正式实验开始前让小鼠任意游泳2 min，让其熟悉实验环境，视力有缺陷和身体不平衡的需剔除。定位航行实验历时5 d，每天分为上午和下午两个时段，分别训练4次，每次90 s，随机选取不同入水点，同一次训练的全部小鼠采用相同的入水点。训练开始时，将小鼠面向池壁轻轻放入水中，系统自动记下小鼠自入水到找到平台所用的时间 (即潜伏期) 及轨迹图等，小鼠找到平台并需在平台上停留5 s。在规定时间内 (90 s) 找平台失败的小鼠，需将其引导到平台，并默认潜伏期为90 s。每次小鼠爬上或被引导到平台，在平台上休息20 s，训练间隔时间为1 h。将小鼠每天4个象限的潜伏期取算术平均值即得到小鼠的平均潜伏期。

空间搜索实验 (spatial probe test, SPT) 实验第5天下午待定位航行实验结束后拿掉平台，随机任意选择一个象限作为入水点，将小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠在90 s内穿越原平台位置的次数和原平台象限游泳时间。

利用小鼠具有趋暗避明的习性设计的装置，一半是暗室，一半是明室，中间有一小洞相连。暗室底部铺有通电的铜栅，并与一计时器相连，计时器可自动记录潜伏期的时间，动物进入暗室即受到电击，计时自动停止。记录小鼠进入暗室前的潜伏期和一定时间内进入的次数，可以反映小鼠的记忆情况。

1) 适应：将动物背向洞口放入明室，让动物在两室内自由活动2-3 min。

2) 训练：开启电刺激仪器，参数设置：电压40 V，时间5 min，将动物背向洞口放入明室，记录5 min内的潜伏期和电击次数。

3) 测验：24 h后进行，将动物背向洞口放入明室，记录5 min内的潜伏期和电击次数。

4) 消退:第5天进行。将动物背向洞口放入明室，记录5 min内的潜伏期和电击次数。实验指标：潜伏期：动物从放入明室开始按实验开始到进入暗室遭电击的计时时间。出错次数：实验时间内小鼠从明室进入暗室受到电击的次数。

实验数据均以x±s进行表示。用SPSS 21.0软件进行分析，P＜0.05时差异有统计学意义。

注射STZ前，与NC组相比，HFSD组小鼠体重增量增加，注射STZ且相应饲料喂养3周后，与NC组比，HFSD组小鼠体重增量增加不明显，差异不显著 (表 1)。注射STZ前，KO组小鼠每只每日进食热能均高于WT组，注射STZ且相应饲料喂养3周后，HFSD组KO小鼠每只每日进食热能比WT组有所增加，NC组差异不明显。在注射STZ前，KO组小鼠空腹血糖低于WT组，KO-NC组和WT-HFSD组小鼠空腹血糖与WT-NC组相比，具有统计学意义 (P＜0.05)。注射STZ且相应饲料喂养3周后，HFSD组小鼠空腹血糖高于NC组，且空腹血糖≥11.1 mmol/L, KO-NC组和WT-HFSD组小鼠空腹血糖与WT-NC组相比，具有统计学意义 (P＜0.05)。

表 1(Table 1)

表 1 注射STZ前后各组小鼠体重的增量、每日进食热能、血糖的变化 (x±s) 项目 时间 WT-NC WT-HFSD KO-NC KO-HFSD 体重增量 (g) STZ前 2.74±0.24 4.23±0.80 4.38±0.34 5.3±0.47 STZ后 0.1±0.01 -1.15±0.27 0.26±0.14 -0.48±0.33 进食热能 (kJ) STZ前 171.80±9.37 150.88±7.70 292.72±10.64 221.48±7.59 STZ后 248.86±4.80 327.02±2.02 243.02±16.74 402.46±8.72 血糖 (mmol/L) STZ前 8.28±0.22 5.86±0.88* 4.18±0.21* 5.22±0.24 STZ后 8.42±0.59 13.3±0.59*△ 6.02±0.65* 12.98±0.91△  与WT-NC组比较，*P＜0.05；与STZ前比较，△P＜0.05；n=7

表 1 注射STZ前后各组小鼠体重的增量、每日进食热能、血糖的变化 (x±s)

在注射STZ后与注射STZ前相比，NC组小鼠体重增量无明显变化，HFSD组小鼠体重增量减少，但是差异不显著 (表 1)。NC组小鼠进食热能无明显变化，HFSD组小鼠每只每日进食热能比之前都有所增加。HFSD组小鼠空腹血糖比之前都有所增加，且空腹血糖≥11.1 mmol/L, 具有统计学意义 (P＜0.05)。

在6周的HFSD且注射STZ诱导小鼠2型糖尿病成模后，KO-HFSD组与WT-HFSD组相比，肝脏重量相差具有统计学意义 (P＜0.05)。KO-HFSD组与WT-HFSD组，KO-NC组与WT-NC组相比，胰腺重量相差具有统计学意义 (P＜0.05)，其他脏器重量差异无明显差异 (表 2)。

表 2(Table 2)

表 2 小鼠脏器重量 脏器重量 (g) WT-NC WT-HFSD KO-NC KO-HFSD 肝脏 1.32±0.04 1.45±0.05 1.25±0.02 1.63±0.07# 胰腺 0.10±0.01 0.07±0.00 0.16±0.02* 0.12±0.02# 左脑 0.06±0.00 0.05±0.01 0.07±0.01 0.06±0.01 右脑 0.16±0.08 0.07±0.01 0.07±0.00 0.06±0.01  与WT-NC组比较，*P＜0.05；与WT-HFSD组比较，#P＜0.05；n=7

表 2 小鼠脏器重量

各组小鼠在实验中，NC组小鼠生长活跃, 皮毛光泽, 体重增加, 反应良好, 精神佳, 无死亡。无论是KO还是WT组，HFSD组小鼠明显精神不振, 反应迟缓, 瘦小, 皮毛无光泽, 部分还有烂尾, 糖尿病的“三多一少”症状明显，且空腹血糖≥11.1 mmol/L，两组之间差异不明显。

综上所述，说明高脂高糖饮食加低剂量链脲佐菌素建立小鼠2型糖尿病模型成功。

在第1天的训练期，潜伏期在各组之间无明显差异，在第2天的测验期和第5天的消退期，潜伏期在各组之间有明显差异，无论是NC组还是HFSD组，KO组均高于WT组，且KO-HFSD低于KO-NC, WT-HFSD低于WT-NC，但第2天的测验期，KO-HFSD与WT-HFSD相比，潜伏期延长，且具有统计学意义 (P＜0.05)(图 1A)。在训练期，测验期和消退期，训练错误次数WT组均高于KO组，且KO-HFSD高于KO-NC, WT-HFSD高于WT-NC, 但差异不显著 (图 1B)。说明CYP1B1基因敲除可改善小鼠2型糖尿病造成的认知功能损害，对2型糖尿病小鼠的学习记忆能力有保护作用。

图 1(Figure 1)

图 1 CYP1B1基因敲除对小鼠神经行为学的影响 A：CYP1B1基因敲除对小鼠被动回避反应避暗实验潜伏期的影响；B:CYP1B1基因敲除对小鼠被动回避反应避暗实验错误次数的影响；与WT-NC组比较，*P＜0.05；与WT-HFSD组比较，#P＜0.05，n=7

5天水迷宫实验显示，随着训练天数的延长，各组小鼠逃避潜伏期均呈缩短趋势，表明小鼠空间学习记忆能力随训练次数增加而增强。HFSD诱导的WT小鼠第3天到第5天的潜伏期显著高于NC组，说明学习能力明显受损 (P＜0.05)。无论HFSD还是NC，KO小鼠的逃避潜伏期均较短 (图 2A)。空间搜索实验测试小鼠的记忆能力，KO组小鼠在原平台象限的时间明显长于WT组，且KO-HFSD组小鼠在原平台象限的时间明显长于WT-HFSD组 (图 2B), 表明CYP1B1基因敲除可改善小鼠2型糖尿病造成的认知功能损害，对2型糖尿病小鼠的学习记忆能力有保护作用。

图 2(Figure 2)

图 2 CYP1B1基因敲除对小鼠神经行为学的影响 A：CYP1B1基因敲除对小鼠水迷宫定位航行实验的逃避潜伏期的影响；B：CYP1B1基因敲除对小鼠水迷宫空间搜索实验的原平台所在象限时间的影响；与WT-NC组比较，*P＜0.05；与WT-HFSD组比较，#P＜0.05，n=7

本实验首次发现CYP1B1基因敲除可改善小鼠2型糖尿病造成的认知功能损害，对2型糖尿病小鼠的学习记忆能力有保护作用。各组小鼠在实验中，NC组小鼠生长活跃, 皮毛光泽, 体重增加, 反应良好, 精神佳, 无死亡。无论是KO还是WT组，HFSD组小鼠明显精神不振, 反应迟缓, 瘦小, 皮毛无光泽, 部分还有烂尾, 糖尿病的“三多一少”症状明显，且空腹血糖≥11.1 mmol/L，两组之间差异不明显, 说明高脂高糖饮食加低剂量链脲佐菌素建立小鼠2型糖尿病模型成功。水迷宫中，WT小鼠在定位航行实验中找到平台的潜伏期比KO小鼠延长，空间搜索实验中，KO小鼠在目标象限的游泳时间比WT小鼠显著延长；在避暗实验中，WT小鼠在测验期和消退期潜伏期比KO小鼠显著缩短且出错次数增加；这些实验结果说明在STZ和高脂高糖诱导的小鼠2型糖尿病模型中，CYP1B1基因的缺失对糖尿病诱导的认知损害有保护作用。

有关糖尿病与认知损伤的研究很多^[7]，具体的机制涉及到氧化应激和炎症反应等^[8]，但目前氧化应激是比较公认的机制^[9]。P450家族可以产生诱导有机体突变的代谢物，并可以产生活性氧簇，从而进一步导致氧化应激和细胞凋亡。有研究显示，抑制CYP1B1会同时降低氧化应激水平和JNK信号，而JNK信号通路在氧化应激中是最显著的。也有研究结果表明，CYP1B1代谢细胞产物从而调节细胞内的氧化应激水平，并且CYP1B1的缺失会引起内皮细胞内氧化应激水平升高。CYP家族和认知功能的关系也得到部分研究的证实，例如CYPs代谢睾丸激素和雌二醇，这些物质属于神经活性类固醇，对认知和记忆有一定的影响；当敲除小鼠脑专属的CYP46A1基因时，会降低脑内的胆固醇水平，并且在人体中CYP46A1的多态性与认知损害有一定的联系^[2]。

我们的前期研究表明，CYP1B1敲除对高脂膳食诱导的氧化应激有抑制作用 (待发表)，因此，CYP1B1敲除对认知功能的保护作用可能与其对机体氧化应激的调节有关。然而，认知行为是一个复杂的神经行为学过程，受动物大脑多种结构和分子的共同调控，因此CYP1B1基因敲除如何影响认知功能的机制有待进一步研究。