息肉状脉络膜血管病变(polypoidal choroidal vasculopathy, PCV)是一种可导致严重视力障碍的眼底疾病，其致病因素多与炎症、吸烟视网膜病变、病理性近视、高血压、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)、局限性脉络膜血管瘤等相关^[1-4]，但其发病机制尚不明确。近年来，眼底疾病的蛋白组学研究愈发受到关注，AMD和脉络膜新生血管(CNV)的血清特异性蛋白已初步确定^[5]，但对PCV血清的研究较少。因此，本研究利用蛋白质芯片技术初步筛选出与PCV相关的特异性蛋白，为临床早期筛查、监测PCV疾病发展及治疗等提供新思路。

选取2016年12月至2017年3月于武汉大学人民医院眼科中心就诊，参考Koh^[6]等制定的专家共识，经常规眼科检查、吸哚菁绿血管造影(ICGA)及光学相干断层扫描(OCT)等确诊为PCV的患者纳入研究组，无眼底疾病的白内障患者纳入对照组。两组患者均无眼底疾病相关治疗史; 均需排除高血压、糖尿病、自身免疫性或感染性疾病、肿瘤、心血管疾病、肺病、肝病、血液病或近6个月有手术史等。

对随机抽取的2例PCV患者及1例对照组的血清进行离心后，采用AAH-BLG-507芯片试剂盒(Raybiotech公司提供)检测相应蛋白的表达水平，分析差异性表达蛋白。实验操作按试剂盒说明书标准操作流程进行。

采用去除背景的荧光信号进行数据分析。蛋白表达量的高低与其荧光信号的强弱呈正相关。将507个因子分别统一化处理，计算去除背景荧光信号值，再行组间比较，得到有差异表达蛋白。

采用Bioworks 3.3软件检索string-bd数据库，SPSS 19.0统计软件进行分析。计量数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差检验，最后得到鉴定的蛋白质结果。P < 0.05为差异有统计学意义。

AAH-BLG-507蛋白芯片检测灵敏度极高，检测量可达pg/ml级别。它的噪音值和背景荧光值均较低且能排除相邻孔之间的相互影响。

利用蛋白芯片AAH-BLG-507检测2例PCV患者和1例阴性对照患者的血清样本时扫描的荧光信号强弱结果，见图 1。

图 1(Figure 1)

图 1 2例PCV患者(A、B)及1例阴性对照患者(C)荧光结果 应用Raybiotech成套试剂(芯片为AAH-BLG-507)完成操作及扫描，扫描的荧光信号强弱结果, 荧光强度越大，表达的量越高

507个因子统一化处理后对比分析发现，79个蛋白表达差异有统计学意义，其中21个表达降低，58个表达增加。将上述79个蛋白输入string-bd数据库分析，获得因子间相互关系(见图 2)，按功能分类主要有新生血管相关因子和生长因子及其受体、胞外基质蛋白/基质金属蛋白酶、趋化因子、细胞因子等4大类。

图 2(Figure 2)

图 2 PCV患者血清差异表达蛋白的相互关系及功能分类 该关系图系将79个变化的蛋白输入string-bd数据库(http://string-db.org/)分析(默认参数)而得。右侧绿色区域系目前已有相关研究报道，左侧红色区域为后续深入研究的细胞因子和趋化因子相关蛋白

PCV高发于老年患者，且视功能损害更为严重，发病率也呈上升趋势; 现有的诊断和治疗方法尚有缺陷^{[7, 8]}。因此探寻一种有效的科学技术手段，寻找新的诊断标志和药物靶点，并对PCV发病机制加以深入研究，仍是眼科领域亟待解决的问题。蛋白质组学技术是近年来广为研究和发展的检测新技术，其主要原理是通过对疾病状态下蛋白表达谱的全面分析，从而筛选出可用于预测或诊断疾病的特异生物蛋白，进而干预或靶向治疗疾病。目前，蛋白质组学研究已经广泛地应用于肿瘤标志物的筛选^[9]，从分子水平分离和鉴定与肿瘤相关的特异性蛋白，有助于深入探索疾病发生机制，便于早期诊断、病情监测、药物研发和预后评估，提高临床诊疗水平^{[10, 11]}。蛋白抗体芯片技术作为蛋白质组学研究的新生物芯片技术，因其高通量、高灵敏度、高特异性、微型化和高度并行性等优势而得以广泛应用。故本研究采用蛋白抗体芯片技术用于初步筛选PCV血清特异性蛋白，探讨其可行性。

本研究利用AAH-BLG-507蛋白芯片全面分析PCV蛋白表达水平，结果显示，有79种差异表达因子，它们主要分为4类：①新生血管相关因子和生长因子及其受体，如表皮生长因子(EGF)，VEGF等; ②细胞外基质蛋白/基质金属蛋白酶及其抑制剂，如细胞间黏附分子-1(ICAM-1)，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的组织抑制剂等; ③趋化因子及其受体如CXCL11，CCL22，CCR5等; ④细胞因子及其受体如白细胞介素、肿瘤坏死因子(TNF)和TNF超家族等。

有研究发现PCV患者VEGF明显升高，并于玻璃体腔注射抗VEGF药物后发现VEGF水平显著降低^{[12, 13]}。本研究中PCV患者VEGF也呈上升趋势，进而证实VEGF参与PCV新生血管形成。有研究发现，相比AMD患者，PCV患者血清中MMP-2和MMP-9水平显著升高^[14]，本研究显示出类似结果，表明MMPs也参与PCV的形成。以上研究均在本实验蛋白芯片结果中予以证实。而趋化因子和细胞因子虽在PCV形成过程中局部表现出动态趋势^{[12, 15]}，但国内外少有采用外周血研究的报道，有待后续深入探讨。

本研究通过少样本的高通量蛋白质组学技术对PCV血清特异性蛋白进行初步筛选，部分实验结果已在既往的报道中得以证实，说明其具有一定的可行性和有效性。后续我们将扩大样本并通过多因子检测技术等进一步验证上述初筛出来的差异蛋白存在与否、相互关系及功能意义等，相关论文将陆续发表。本次研究筛选出的PCV血清特异性蛋白，为探寻其作用机制及开发新的诊疗技术和靶点药物奠定了基础。