近年来，我国恶性黑色素瘤发病率快速增长，每年新发病例约2万例^[1]。皮肤恶性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma, CMM)是恶性黑色素瘤中最常见的类型，侵袭性高，5年生存率较低。CMM的发生、发展同其它肿瘤类似，是细胞DNA多重损伤的一个复杂过程。有研究表明，Sox2基因、Pten基因、Stat3基因、Vegf基因在恶性肿瘤的生长、增殖、侵袭、转移中有重要作用^[2-5]。这4个基因是否参与CMM的发病至今尚没有明确报道。本文就Sox2, Pten, Stat3, Vegf在CMM和交界痣中的表达进行检测，探讨这些基因在CMM发生中的作用。

选取南京医科大学第一附属医院病理科2012-2015年手术切除27例CMM和10例交界痣标本蜡块。经过重新复阅切片，病理诊断明确。

① 兔抗人SOX2单克隆抗体(编号bs-0523R, 北京博奥森生物技术有限公司);② 兔抗人PTEN单克隆抗体(编号IPW1525, 南京派为生物技术有限公司);③ 兔抗人STAT3单克隆抗体(编号IPW0866，南京派为生物技术有限公司);④ 兔抗人VEGF单克隆抗体(编号11232-2-AP，Proteintech中国分公司);⑤ DAB显色试剂盒(北京中杉生物科技有限公司);⑥ 免疫组织化学染色试剂盒(北京中杉生物科技有限公司);⑦ 抗原修复液、PBS均为自配。

标本取材后即刻10%甲醛固定，常规病理石蜡切片制作，切片厚度4 μm。免疫组化法检测各标本中Sox2, Pten, Stat3, Vegf的表达：石蜡切片脱蜡至水，切片浸入柠檬酸钠溶液(pH 6.0)，煮沸喷气2 min以修复抗原，后置于室温自然冷却，PBS冲洗：滴加第一抗体(Sox2，Stat3，Pten，Rb)，4 ℃过夜，PBS冲洗，加二抗，室温20 min，PBS冲洗，DAB显色，充分水洗，苏木素复染细胞核，充分水洗、1%盐酸乙醇分化、1%胺水反蓝、充分水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。已知染色阳性的组织切片作阳性对照，阴性对照以代替一抗孵育组织切片。

SOX2蛋白阳性标准：细胞核染呈棕黄色；PTEN蛋白阳性标准：细胞核或细胞质呈棕黄色；STAT3蛋白阳性标准：细胞质呈棕黄色；VEGF蛋白阳性标准细胞质着色。实验结果判定：随机选5个高倍镜视野，每一个视野计数100个细胞。①根据阳性细胞面积分级，呈阴性的视野：记0分，阳性细胞面积/总面积：≤25%记1分，26%-50%记2分，51%-75%记3分，≥75%记4分；②根据着色强弱分级，视野不着色：记0分，着色弱：记1分，着色中：记2分，着色强：记3分。每一个标本的两项指标分数乘积为最终计分^{[6, 7]}。

采用SPSS 17.0软件处理实验数据，各因子在CMM和交界痣之间表达的差异采用方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

27例CMM和10例交界痣根据阳性细胞面积分级和着色强弱分级分数乘积计分，不同计分例数如表 1所示，Sox2和Pten蛋白表达在CMM组和交界痣组比较有统计学差异(P＜0.05);Stat3、Vegf蛋白表达在CMM组和交界痣组比较无统计学意义(P＞0.05)。

表 1(Table 1)

表 1 Sox2、Pten、Stat3、Vegf蛋白在CMM和交界痣中表达结果计分例数分布(n) 计分 Sox2 Pten Stat3 Vegf CMM 交界痣 CMM 交界痣 CMM 交界痣 CMM 交界痣 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 2 0 0 1 0 0 0 1 0 3 1 1 0 0 1 0 3 0 4 0 2 1 0 0 0 0 2 6 5 0 9 0 4 1 4 0 8 4 6 11 2 4 7 1 6 9 5 0 4 0 7 0 5 0 12 12 1 1 8 11 1 12 2 P ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＞0.05

表 1 Sox2、Pten、Stat3、Vegf蛋白在CMM和交界痣中表达结果计分例数分布(n)

免疫组化检测Sox2、Pten、Stat3、Vegf蛋白在CMM和交界痣中表达情况见图 1-4。

图 1(Figure 1)

图 1 Sox2蛋白在CMM和交界痣中的表达(免疫组化×20) A:CMM标本Sox2的表达，细胞核染呈棕黄色为阳性；B:皮肤交界痣标本Sox2的表达

图 2(Figure 2)

图 2 Pten蛋白在CMM和交界痣中的表达(免疫组化×20) A:CMM中Pten的表达，细胞核或细胞质呈棕黄色为阳性；B:交界痣中Pten的表达

图 3(Figure 3)

图 3 Stat3蛋白在CMM和交界痣中的表达(免疫组化×20) A:CMM中Stat3的表达，细胞质呈棕黄色为阳性；B:交界痣中Stat3的表达

图 4(Figure 4)

图 4 Vegf蛋白在CMM和交界痣中的表达(免疫组化×20) A: CMM中Vegf的表达，细胞质着色为阳性；B:交界痣中Vegf的表达

CMM是发生于皮肤黑色素细胞的高度恶性肿瘤，早期即可发生远处转移，且传统抗肿瘤治疗疗效差，5年生存率低。CMM的发病机制尚未完全明确，可能与遗传、外伤刺激、过度日晒等多种因素导致基因突变有关。对CMM发生及发展机制的研究，可为预测恶变、早期诊断提供理论依据，并为CMM的治疗提供新线索。

肿瘤的发生、侵袭及转移依赖于肿瘤细胞和血管、淋巴管之间的信号转导，研究表明，Sox2、Pten、Stat3、Vegf基因在多种恶性肿瘤的发生、侵袭及转移的信号转导中起了重要作用。

Sox2为Sox基因家族成员，编码在结构上与SRY(Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段)相关的转录因子，编码的转录因子对胚胎干细胞的多能性和自我更新能力非常重要^[8]。Wang等^[9]发现Sox2因子与胃癌患者的预后有密切联系。另外在多形性胶质母细胞肿瘤细胞中，Sox2的表达由Polo样激酶1(polo-like kinase1, PLK1)调节，在小鼠体内PLK1抑制剂可以延缓肿瘤的进展^[10]。有研究表明Sox2蛋白能够增强黑色素瘤细胞的浸润能力^[3]。

Pten是具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，可调节细胞内多种信号转导的途径，从而调控细胞周期，促进细胞凋亡、抑制细胞生长。Pten的失活在许多肿瘤的发生过程中起重要作用。Roh等^[11]发现Pten启动子甲基化程度不同的患者其临床症状及预后有统计学差异，认为Pten启动子的甲基化程度是黑色素瘤预后的一个相对独立的负性预测因素。

新生血管的形成在肿瘤的侵袭和转移中是一个必不可少的过程。血管内皮细胞生长因子VEGF可选择性调节血管内皮细胞迁移、增生和管腔形成，在多种细胞与血管生成相关的进程中表达。Ni等^[12]发现通过质粒转染过表达的Vegf能够显著提高恶性黑色素瘤细胞的侵袭性，推测Vegf在CMM的侵袭和转移过程中起到重要的作用。

Stat3基因是信号传导子与转录激活子家族(signal transducers and activators of transcription, STATS)的重要成员之一，在传导信号和肿瘤形成中起到重要作用。Xu等^[4]研究发现，Stat3能够结合Vegf的启动子区进而上调Vegf的转录，从而促进肿瘤新生血管的形成，使肿瘤的侵袭性增强。在人类黑色素瘤细胞中，可以通过NF-YA(nuclear transcription factor-Y alpha，核转录因子α)基因来上调Stat3相关的信号通路，进一步上调Vegf的转录来促进肿瘤的血管生成。Yin等^[13]发现抑制Stat3蛋白的表达，从而抑制小鼠的恶性黑色素瘤细胞的增殖。

到目前为止，有关Sox2, Pten, Stat3和Vegf与CMM发生的关系国内外鲜少有报道。CMM有相当一部分来自于交界痣的恶变。而基因突变在良性痣细胞恶变为CMM的过程中起着重要作用^[14]。我们选择交界痣与CMM作比较，研究两组病理组织标本Sox2, Pten, Stat3和Vegf基因的表达情况。结果显示Sox2在皮肤恶性黑色素瘤中的表达明显高于皮肤交界痣。Pten在皮肤恶性黑色素瘤中的表达明显低于皮肤交界痣。Stat3、Vegf在CMM中和交界痣中的表达无统计学差异。与既有文献结果进行比较，Sox2、Pten在CMM的形成中可能发挥了其信号转导作用。Sox2的高表达可能通过促进细胞自我更新，使潜在恶性的细胞分裂活跃，无限增殖^[15]，促进了CMM的发生，Pten的高表达可能通过激活具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，抑制了CMM的发生，Stat3、Vegf并未直接参与CMM的发生。上述结果可能因标本数量所限或其他基因的影响干扰了结果，有待进一步实验的证实。

Sox2在CMM中表现的是癌基因特性，可能起促癌作用；而Pten在CMM中表现的是抑癌特性，因此Sox2、Pten可以作为鉴别CMM和交界痣以及监测黑色素细胞恶变的参考指标。