国际糖尿病联盟(international diabetes federation, IDF)最新数据显示，2013年，在世界范围内有3.82亿糖尿病患者，至2035年糖尿病患者人数将上升到5.92亿，中国2013年糖尿病的患病人数为9 840万，居全球首位；到2035年，中国的糖尿病患病人数将达到1.43亿^[1]。有研究表明，低度慢性炎症状态在肥胖和2型糖尿病的发生发展中起着重要的作用。脂肪组织和肌肉组织中浸润的巨噬细胞产生的炎症因子，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)等，可促进胰岛素抵抗的形成^[2]，而胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的关键环节之一。C反应蛋白(CRP)也与胰岛组织炎症密切相关，2型糖尿病患者的胰岛组织可表现出典型的炎症反应，进一步导致胰岛β细胞功能障碍。有研究表明，循环中炎症因子大部分来自于外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，同时PBMCs可迁移至脂肪组织，激活脂肪组织产生炎症因子，如TNF-α、IL-6。因此，PBMCs可作为研究及评价全身炎症反应和胰岛素抵抗相关性的模型^[3]。

核受体是一种可调控代谢或炎症反应的重要受体。NR2E1(nuclear receptor subfamily 2，group E，member 1)属于核受体中的孤儿核受体，广泛表达于中枢神经系统、胰岛、肾上腺、脾脏、淋巴细胞等组织细胞。有研究发现NR2E1敲除小鼠的体重与脂肪垫含量较对照组明显减少^[4]。同时，一项全基因组关联分析(GWAS)研究表明，肉牛中转录因子PPARGC1A、HNF4G可与NR2E1协同作用调节肌肉内脂肪沉积^[5]。在人类遗传学研究中，PPARGC1A与胰岛素抵抗、肥胖和2型糖尿病的易感性密切相关，HNF4G与高度肥胖相关。在2型糖尿病发生发展过程中，目前尚无NR2E1与慢性炎症反应相关性的研究。本研究旨在通过测定29名新诊断2型糖尿病患者及48名健康志愿者PBMCs中NR2E1的表达水平、血清中炎症因子水平，分析NR2E1与炎症因子TNFα、IL-6的相关性，测定健康对照志愿者PBMCs经16.7 mmol/L葡萄糖、250 μmol/L棕榈酸刺激后NR2E1与炎症因子TNFα、IL-6的表达水平，以探讨NR2E1的表达与新诊断2型糖尿病患者慢性炎症状态间的关系。

29例糖尿病组研究对象来自2013年8月至2014年3月间于武汉大学中南医院就诊的新诊断的2型糖尿病患者，其中男性21例，女性8例。所有入组患者2型糖尿病的诊断依据参照WHO糖尿病专家委员会(1999)提出的诊断和分类标准，并排除急性感染、应激状态、高血压病、心血管疾病以及肝肾疾病等慢性疾病。对照组为2013年8月至2014年3月间于武汉大学中南医院体检中心筛选出的健康体检者，共48例，经糖耐量试验，排除糖尿病患者，并详细询问既往史，其中男性28例，女性20例。所有研究对象签署知情同意书。

通过调查问卷的方式收集研究对象的基本资料、既往史及家族史，由专业医务人员测量身高、体重，体重指数(BMI)=体重/身高²(kg/m²)。

清晨空腹状态下抽取研究对象的静脉血，于我院检验科测定空腹血糖(FBG)、空腹血清胰岛素(FIN)、糖化血红蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFAs)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)等指标的水平。稳态模型评估胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FIN (μU/mL)×FBG (mmol/L)/22.5。

抽取研究对象空腹静脉血2 ml于含有肝素钠的试管中，加入2 ml外周血单个核细胞提取液(天津灏洋生物科技公司)，2 000 r/min离心25 min，收集第2层中PBMCs，使用PBS溶液洗涤细胞2次，2 000 r/min离心10 min，收集PBMCs用于后续实验。

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬PBMCs，以2 ml/孔接种至6孔板内，37 ℃ 5% CO₂培养至70%-80%融合后，弃上清，加入新鲜的含0，16.7 mmol/L葡萄糖以及250 μmol/L棕榈酸继续培养24 h。

采用RNA提取试剂盒(北京赛百盛公司)，按照说明书提取PBMCs总RNA，并采用紫外分光光度计测定RNA在260 nm和280 nm处吸光值以评价RNA样品纯度。总RNA采用逆转录试剂盒(Promega)逆转录为cDNA，置于-80 ℃冰箱中保存备用。Primer premier 5.0软件设计引物如下：NR2E1(NM_003269.4)上游引物5′-TGAGTGAGGTAGATTGCTGTCC-3′，下游引物5′-ATTCGTTTCCTGTCTGGTGTG-3′；β-actin (NM_001101.3)上游引物5-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，下游引物5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′(引物由上海生物工程有限公司合成)。反应体系25 μl，包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(日本Takara公司)12.5 μl，上下游引物各1 μl，ROX Reference Dye Ⅱ(日本Takara公司)0.5 μl，cDNA模板2 μl，余下体积不足部分由双蒸水补足。荧光实时定量PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次，最后72 ℃延伸10 min，通过熔解曲线图评估PCR产物纯度。Mx3000P软件分析扩增曲线确定周期阈值(Ct)。以β-actin为内参校正每个样品的Ct值。以2^-ΔΔCT表示糖尿病组及对照组中目标基因表达水平的倍数变化比。

应用蛋白变性裂解液提取上述PBMCs中的总蛋白，测定蛋白浓度后，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转印至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的PBS-T溶液封闭，分别用稀释后的一抗(1:500兔抗人NR2E1, 1:10 000兔抗人GAPDH)(美国Santa Cruz)孵育，洗脱后用HRP标记的山羊抗兔二抗(1:10 000)孵育过夜，ECL发光液暗室曝光显色，扫描胶片，AlphaEaseFC 4.0软件分析灰度值，以NR2E1蛋白和GAPDH的灰度比值表示NR2E1蛋白表达水平。

采用人TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒(武汉博士德公司)，依照试剂盒说明书测定血浆及条件刺激细胞培养上清中TNF-α和IL-6浓度。

采用SPSS 19.0分析数据，结果均以均数±标准差(x±s)表示，正态分布资料采用两独立样本t检验，变量的线性关系采用Person’s相关性分析。P < 0.05代表差异有统计学意义。

研究人群的临床特征如表 1所示，对照组和糖尿病组研究对象年龄、性别、身高、体重等指标间均无统计学差异。糖尿病患者组FBG、FIN、HbA1c、TG、FFAs和HOMA-IR、hs-CRP较对照组明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。

表 1(Table 1)

表 1 各组研究人群的临床特征(x±s) 变量 糖尿病组 对照组 P 年龄(岁) 50.79±9.53 49.52±10.46 0.586 性别(男/女) 21/8 28/20 0.209 BMI (kg/m 2) 22.68±2.72 22.13±1.05 0.220 TG (mmol/L) 1.88±0.48 1.17±0.19 0.01 FFA (mmol/L) 0.43±0.19 0.20±0.06 0.01 FBG (mmol/L) 11.29±3.94 4.84±0.31 0.01 FIN (μU/ml) 13.61±6.71 5.93±0.95 0.01 HbA1c (%) 7.96±1.53 5.24±0.37 0.01 HOMA-IR 6.82±4.29 1.28±0.22 0.01 hs-CRP (mg/L) 1.70±0.73 1.11±0.59 0.05

表 1 各组研究人群的临床特征(x±s)

糖尿病组PBMCs中NR2E1 mRNA相对表达量较对照组升高(2.03±0.74 vs 1.36±0.70，P＜0.01)，NR2E1蛋白表达水平较对照组显著升高(0.182±0.046 vs 0.085±0.007，P＜0.01)(图 1)。健康志愿者外周血分离PBMCs分别给与16.7 mmol/L葡萄糖以及250 μmol/L棕榈酸刺激24 h后，NR2E1 mRNA水平较未刺激PBMCs组明显上调(0 vs 16.7 mmol/L葡萄糖：1.59±0.29 vs 3.14±0.22，P＜0.01；0 vs 250 μmol/L棕榈酸：5.96±0.77 vs 1.35±0.33，P＜0.01)；NR2E1蛋白表达水平也明显增加(0 vs 16.7 mmol/L葡萄糖：0.095 5±0.009 4 vs 0.180 0±0.013 0，P＜0.01；0 vs 250 μmol/L棕榈酸：0.106±0.031 vs 0.403±0.069，P＜0.01)(图 2，图 3)。

图 1(Figure 1)

图 1 Western blotting法检测对照组及糖尿病组外周血单个核细胞中NR2E1蛋白表达水平 A. NR2E1 mRNA相对表达量；B. Western blot检测NR2E1蛋白水平表达；C.经GAPDH为内参校正后NR2E1蛋白相对表达量ontrol group=对照组，diabetes group=糖尿病组；GAPDH蛋白分子质量为37 kU，NR2E1蛋白分子质量为43 kU；**P＜0.01

图 2(Figure 2)

图 2 体外16.7 mmol/L高糖刺激培养PBMCs后NR2E1 mRNA及蛋白水平 A. NR2E1 mRNA相对表达量；B. Western blot检测NR2E1蛋白水平表达；C.经GAPDH为内参校正后NR2E1蛋白相对表达量；D.细胞上清液中TNF-α及IL-6的浓度；**P＜0.01

图 3(Figure 3)

图 3 体外250 μmol/L棕榈酸(PA)刺激培养PBMCs后NR2E1 mRNA及蛋白水平 A. NR2E1 mRNA相对表达量；B. Western blot检测NR2E1蛋白水平表达；C.经GAPDH为内参校正后NR2E1蛋白相对表达量；D.细胞上清液中TNF-α及IL-6的浓度；**P＜0.01

糖尿病组患者血浆TNF-α和IL-6浓度高于对照组[分别为(94.54±28.94) vs (49.21±6.95) pg/ml，P＜0.01；(18.53±6.58) vs (7.53±1.15) pg/ml，P＜0.01]。同时，16.7 mmol/L葡萄糖及250 μmol/L棕榈酸刺激PBMCs的上清中TNF-α和IL-6的浓度较未刺激组明显增加[分别为0 vs 16.7mmol/L葡萄糖：TNF-α: (98.00±9.30) vs (21.60±2.42) pg/ml，P＜0.01；IL-6 (17.78±1.58) vs (7.54±0.87) pg/ml，P＜0.01；0 vs 250 μmol/L棕榈酸：TNF-α: (122.55±15.61) vs (22.03±2.04) pg/ml，P＜0.01；IL-6 (29.01±1.62) vs (7.58±0.60) pg/ml，P＜0.01]。

在年龄、性别、BMI均衡的情况下，NR2E1 mRNA与HbA1c (r=0.772，P＜0.01)、HOMA-IR指数(r=0.811，P＜0.01)以及FFAs (r=0.752，P＜0.01)呈明显正相关。此外，NR2E1 mRNA与炎症相关因子，如hs-CRP (r=0.492，P＜0.05)，TNF-α蛋白(r=0.625，P＜0.01)，IL-6蛋白(r=0.630，P＜0.01)密切相关。

本研究首次发现新诊断2型糖尿病患者外周血单个核细胞中NR2E1 mRNA和蛋白水平较对照组明显增加，健康志愿者PBMCs经高糖、高脂刺激后NR2E1的表达较未刺激组明显升高。仅在真涡虫中观测到进食状态中NR2E1表达较空腹状态高^[6]，目前尚无NR2E1与糖脂代谢相关的研究报道。NR2E1能够募集P53、Pax6、Gli2(GLI family zinc finger 2)等辅助因子及调控SHH (sonic hedgehog)、Wnt/β-catenin、MAPK (mitogen-activated protein kinases)等信号通路^[7]，其中Pax6、Gli2等转录因子与胰岛β细胞功能密切相关^[8]。我们推测，高糖高脂可能增加NR2E1的表达，但NR2E1与糖脂毒性的相互作用机制尚需进一步研究。

慢性低度炎症和免疫系统的活化在2型糖尿病发生发展中起着重要作用。在2型糖尿病患者的脂肪组织、肝脏、肌肉和胰腺中均可观察到炎症反应，并伴有巨噬细胞的浸润。巨噬细胞分泌的促炎性细胞因子包括TNF-α、IL-6和IL-1β以自分泌和旁分泌的方式激活JNK通路和NF-κB通路从而干扰外周组织胰岛素信号传导，促进胰岛素抵抗。同时，游离脂肪酸也可激活NF-κB通路促进TNF-α、IL-6等炎症因子的释放，进一步促进胰岛素抵抗的形成。C反应蛋白(CRP)是IL-6调控下肝脏分泌的炎症反应标记物，超敏CRP (hs-CRP)与胰岛素抵抗相关。长期高浓度炎症因子刺激可导致β细胞功能障碍和凋亡^[9]。慢性低度炎症刺激能引起胰岛β细胞数量减少，功能障碍以及糖刺激胰岛素分泌减少^{[10, 11]}。我们的研究显示，新诊断2型糖尿病患者外周血中游离脂肪酸，hs-CRP、炎症因子TNF-α、IL-6表达水平较对照组明显升高。体外培养的健康志愿者PBMCs经高糖高脂刺激后炎症因子的表达较未刺激PBMCs明显升高。这些结果与之前的研究相符^[12]。同时，我们的研究首次发现新诊断2型糖尿病患者NR2E1表达水平与TNF-α、IL-6表达水平呈正相关。有文献报道中枢神经系统涉及免疫及炎症紊乱相关疾病，如神经退行性病变，与NR2E1有关^[13]。NR2E1能够调控炎症因子IL-1β对NSPCs (neural stem progenitor cells)增殖和分化的损伤^[14]，在NSPCs中可观察到IL-1β与NR2E1表达呈剂量依赖性。我们的研究提示，其他的炎症相关疾病，如2型糖尿病，也可能与NR2E1表达有关。我们的研究结果表明在新诊断2型糖尿病患者中，NR2E1表达水平与HbA1c、TG、HOMA-IR等因素相关，进一步提示NR2E1表达水平可能与糖脂水平，胰岛素抵抗相关，但尚需在动物与细胞实验中通过敲除或过表达NR2E1进一步研究NR2E1在糖脂代谢中的作用。