2019, Vol. 3
2. 湖南省急救医学研究所中毒研究室
2. Poison Research Lab of Hunan Provincial Institute of Emergency Medicine People's Hospital, Changsha, China
百草枯(PQ，1, 1'-二甲基-4-4'-联吡啶二氯化物)是一种广泛用于农业，对包括人在内的哺乳动物具有高毒性的季铵盐除草剂[1]，可通过皮肤、呼吸道、消化道进入人体，人经口的致死量为30~40mg/kg。急性中毒患者死亡率极高[2]，达60%~80%[3]。随着血液净化、机械通气、体外膜肺氧合等先进技术的出现，急性百草枯中毒的治疗效果已取得较大进展，但致残率、死亡率并未明显改善[4]。代谢组学通过考察生物体系(细胞、组织或生物体)受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学[5]。在本研究中，采用GC-MS技术分析不同剂量百草枯急性中毒大鼠血浆代谢谱，随机森林(RF)算法分类识别不同剂量中毒大鼠[6]，结合肝肾功能探索不同剂量百草枯中毒血浆代谢物的变化，进而使用典型相关分析(CCA)分析百草枯中毒大鼠血清肝肾功能与百草枯中毒代谢物之间的相关性，探索急性百草枯中毒病情严重程度的潜在生物标志物，开发代谢组学方法在临床诊断及救治中的辅佐作用。
对象与方法 一、百草枯中毒大鼠模型及生化指标检测雄性SD大鼠24只，重180g~220g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号：SYXK(湘)2010-0013，分生理盐水对照组和百草枯染毒剂量组(低剂量中毒组、中剂量中毒组和高剂量中毒组)，每组6只。其中空白对照组采用生理盐水灌胃，低剂量中毒组、中剂量中毒组、高剂量中毒组分别以40mg/kg、80mg/kg、120mg/kg百草枯(20%PQ溶液，先正达南通作物保护有限公司)灌胃。观察大鼠进食、活动、呼吸、紫绀等表现。24h后收集大鼠血浆、肺组织。采用HE染色检测肺组织的损伤程度，采用谷丙转氨酶检测试剂盒(IFCC法)测定大鼠血浆中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平；采用脲酶法测定大鼠血浆中尿素氮(BUN)，采用酶法测定大鼠血浆中肌酐(Cr)水平。
二、基于GC-MS的百草枯模型代谢组学检测向150 μL百草枯中毒大鼠血浆中加入800μL甲醇、乙腈和丙酮的混合溶液{甲醇：乙腈：丙酮=1：1：1(v/v)}冰浴超声10min后12 000r/min离心15min，吸取上清并氮气吹干，加入75μL甲氧胺吡啶溶液70 ℃反应1h，BSTFA+1%TMCS溶液75μL室温反应1h后，加入150μL正庚烷(含0.1g/L内标物质二十二烷)终止反应，进行气相色谱质谱分析。
三、代谢物鉴定使用Aglient MSD chemstation工作站对GC-MS总离子流图中的各种代谢物峰面积进行定量；利用NIST数据库对血浆中的代谢物进行定性；并将其输入到Matlab软件进行分析。
四、数据统计学分析肝肾功能生化指标经完全随机设计资料的方差分析，采用S-N-K(S)法进行两两比较，取按α=0.05水准。代谢物定量值用Dunnett检验方式各中毒组分别与对照组进行比较。所有数据分析均在IBM SPSS Statistics 19软件上计算完成。
结果 一、大鼠的一般情况观察与空白对照组相比，低、中剂量PQ中毒大鼠出现食量减少、少动的现象，除此之外，高剂量PQ中毒大鼠死亡1只，余存活大鼠还出现气促、腹部抽动和嗜睡的情况。
二、百草枯中毒致大鼠肝肾功能损伤各组数值经完全随机设计资料的方差分析可得PALT=0.62，PBUN=0.105，PCR=0.144, 按α=0.05的水准, 即24h 4个处理组的ALT、BUN、CR指标的总体方差齐同。故各组采用S-N-K(S)法进行两两比较，可得FALT=12.504，PALT=0.01; FBUN=4.3，PBUN=0.034；FCR=6.37，PCR=0.011；P值均小于0.05；即低、中、高剂量组百草枯中毒大鼠血浆中ALT、BUN、CR含量存在明显差异，且存在剂量依赖性。完全随机设计资料的方差分析发现PAST=0.004，P < 0.1，认为24h 4个处理组AST指标的总体方差不齐，即本组数据不满足方差分析的适应条件，因此本组数据采用非参数统计方法—Kruskal-Wallis H检验，可得H=10.468，自由度=3，P=0.015，按照α=0.05的水准，认为大鼠接受不同剂量百草枯后AST升高有差别。
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表 1 24h各组肝肾功能生化指标(x±s) |
采用HE染色检测百草枯中毒大鼠肺损伤情况，结果如图 1所示：空白对照组肺泡结构清晰完整，肺泡腔及肺间质无渗出，无炎症细胞浸润。低剂量百草枯染毒组肺泡结构出现明显改变，可见部分肺泡塌陷，肺泡腔及肺间质可见少许渗出。中、高剂量百草枯染毒组肺泡正常结构基本消失，肺泡闭塞塌陷，肺间质内炎症细胞浸润。
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图 1 PQ中毒大鼠肺部病理切片镜下观 |
本实验通过NIST标准质谱库和标准品对大鼠血浆中的代谢物进行定性分析，鉴定出氨基酸、糖类、脂肪酸、有机酸等30种代谢物质，见表 2。百草枯中毒大鼠相比于对照组，总体上苯乙酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、D-果糖、D-甘露糖、糖苷、肌醇、亚油酸、油酸的含量在中毒组含量增加，丙酸、乙酸、磷酸盐、谷氨酰胺、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-络氨酸、葡萄糖肟、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸的含量在中毒组剂量减少，这与文献报道的大致相似[7, 8]，L-丝氨酸、L-苏氨酸，L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸是蛋白质代谢的产物；亚油酸、油酸是不饱和脂肪酸，参与脂质代谢；糖苷、D-果糖参与糖代谢；磷酸盐是生命的重要组成部分，磷酸盐最常见的形式是腺苷磷酸盐，反应能量代谢；这表明百草枯中毒后蛋白质、脂肪、糖及能量代谢均发生了改变。
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表 2 基于GC-MS筛选出的不同浓度百草枯染毒大鼠血浆差异性代谢物 |
将不同剂量PQ中毒大鼠内源性代谢物定性定量分析后，我们采用Matlab软件进行PCA分析，结果如图 2，与空白对照相比，不同百草枯中毒剂量组大鼠的血清代谢物轮廓存在显著差异，且中毒剂量越大，百草枯中毒大鼠的血清代谢物轮廓特征与空白对照组的差异越显著。采用随机森林算法分析差异代谢物对中毒大鼠代谢轮廓特征变化贡献度发现，乙酸、乙二酸、草酸、L-丙氨酸、D-果糖、葡萄糖肟、谷氨酰胺、丙酸、肌醇、苯乙酸是引起百草枯中毒大鼠血清代谢轮廓特征变化的关键差异代谢物，结果如图 3。
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图 2 PCA分析PQ中毒大鼠代谢轮廓特征 |
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图 3 对4类大鼠分类鉴别起到重要作用的各代谢物所占比重 |
PQ中毒大鼠肝肾功能指标以及代谢物质信息进行典型相关分析，见图 4。两组特征之间的相关性比较大，相关系数R为0.92。
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图 4 PQ中毒大鼠肝肾功能指标、代谢物质典型相关性分析 |
相关性分析中对特征值贡献度比较大的代谢物质和临床指标，其结果分别见图 5和图 6。代谢物L-脯氨酸，L-苯丙氨酸，酪氨酸、肌醇和生化指标ALT、AST、BUN、CR对两组特征的相关性贡献最大。
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图 5 代谢产物相关贡献值 |
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图 6 生化指标相关贡献值 |
急性百草枯中毒在短时间内易引起肝、肺、心脏和肾等多器官衰竭[9]，严重威胁患者的生命。美国毒物控制中心国家毒物数据系统协会报告百草枯农药中毒的死亡率高于其他任何杀虫剂[10]，临床上百草枯中毒救治成功率较低，致死率极高，正确、有效的病情评估可用于指导百草枯中毒的临床诊疗，对提高百草枯中毒救治效果具有重要的意义。
目前临床上主要依赖中毒严重程度评分(the poisoning severity score, PSS)[11]和急性生理学及慢性健康状况评分Ⅱ(APACHE Ⅱ)[12]实现对百草枯中毒患者死亡风险的预测。但由于PSS、APACHE评分缺乏重要的毒理学依据，且无法预测多脏器功能衰竭的发生；同时两种方法对中毒程度的评估存在滞后性，故并非百草枯中毒患者病情评估的理想方法。
代谢组学是检测和量化生物整体代谢的变化规律和轨迹，反映某种病理(生理)过程中所发生的一系列生物事件，被广泛地应用于人类疾病研究，生物标志物鉴定，药物评价和治疗预后[13]。研究急性百草枯中毒大鼠肝、肾、肺组织的代谢组学发现：百草枯中毒可致大鼠能量代谢、氨基酸代谢和脂肪酸代谢紊乱。在肺组织中，L-丝氨酸、十六酸、十八酸水平上调，而L-亮氨酸、L-脯氨酸、肌醇、红血丝、UA、9h-嘌呤水平下调。在本研究中，我们发现百草枯染毒剂量越大，SD大鼠出现食量减少、少动、气促等临床症状越明显，肺部病理切片示肺组织遭到破坏越严重，肝肾功能损伤越严重，说明我们成功制定了不同严重程度的百草枯中毒大鼠模型，采用GC-MS对百草枯中毒大鼠血清进行代谢组学检测发现了30种差异性内源性代谢物，且代谢轮廓发生了明显改变；PCA分析提示中毒剂量越大，百草枯中毒大鼠的血清代谢物轮廓特征与空白对照组的差异越显著，提示基于GC-MS技术的百草枯中毒血浆代谢组学研究可用于评估百草枯急性中毒病情。
对不同剂量的大鼠代谢物信息进行随机森林算法分析发现：乙酸、乙二酸、草酸、L-丙氨酸、D-果糖、葡萄糖肟、L-谷氨酰胺、丙酸、肌醇、苯乙酸是百草枯中毒大鼠代谢轮廓特征变化贡献度最大的小分子代谢物，可作为评估百草枯急性中毒病情严重程度的潜在生物标志物。同时，随着急性百草枯中毒剂量不同，体内的氨基酸、葡萄糖、脂肪、能量代谢变化不同。在低剂量(40mg/kg)的百草枯中毒剂量组的大鼠中，作为碳水化合物代谢终产物的丙酸、乙酸水平升高，提示百草枯中毒致使大鼠糖代谢增加；而L-丝氨酸、L-苏氨酸、烷基胺类有机化合物升高，可认为蛋白质代谢增强；肌醇的升高，考虑ATP、ADP等能量代谢增加，因此，低剂量急性百草枯中毒大鼠处于应激状态，蛋白质、糖代谢及能量代谢均增强。80mg/kg、120mg/kg的中、高剂量百草枯中毒大鼠的代谢物中，丙酸、乙酸等碳水化合物终产物减少，糖苷进行升高，三羧酸循环受到干扰，说明糖代谢减弱，亚油酸、油酸不饱和脂肪酸含量增加，丁酸、甘油含量减少，说明脂质代谢减弱，L-苏氨酸、L-丝氨酸，L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、L-络氨酸、L-脯氨酸含量减少，提示总体上蛋白质代谢减弱，同时肌醇的增高、谷氨酸盐的减少提示ATP、ADP继续消耗，能量储备减少，大鼠处于耗竭状态。
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