2019, Vol. 3
2. 海军军医大学长海医院麻醉学部
2. Faculty of Anesthesiology, Changhai Hospital, Naval Medical University, Shanghai, China
脓毒症(Sepsis)的最新定义为宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍[1, 2]。全球脓毒症患者每年约为1 800万例，死亡率为28%~40%，脓毒性休克患者死亡率更高达50%~85%，是全球重症监护病房危重患者死亡的主要原因之一[3]。适度调节脓毒症患者的炎症免疫反应，可提高其对病原微生物的防御和杀伤能力，从而减轻组织损伤。然而，严重的炎症反应可造成免疫功能障碍，过度激活的炎症反应或免疫抑制可致器官功能障碍或继发感染[4]。
细胞焦亡(pyroptosis)是一种依赖半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)激活的程序性细胞死亡模式。细胞焦亡的特征表现为细胞膜出现微孔、细胞肿胀破裂、细胞内容物释放、分泌炎症因子、促进固有免疫和细胞死亡的发生等[5]。研究表明，炎性体激活以及炎性体依赖的细胞焦亡在脓毒症的发生发展中具有重要作用[6, 7]。细胞焦亡也通过破坏受感染的细胞，促使病原体释放而被免疫细胞吞噬及杀灭，从而促进机体提呈抗原以及清除胞内病原体。脓毒症时，适度的细胞焦亡可保护机体抵御病原微生物感染，细胞焦亡过度激活却可能加重脓毒症和脓毒性休克[8]。
一、经典炎性体与焦亡多种病原体及其产生的毒素入侵机体后，被细胞模式识别受体识别，诱导炎性体组装和激活，促进Caspase-1活化，导致炎性因子IL-1β和IL-18等成熟和分泌，继而可诱导细胞焦亡[9]。在脓毒症与炎性体的研究中，核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)是研究最广泛、最深入的一种炎性体。NLRP3与凋亡相关的含有CARD结构的斑点样蛋白(ASC)相互作用，随后募集前半胱天冬酶1(Pro-caspase-1)并对其进行切割形成有活性的Caspase-1，进而激活下游相关信号分子，从而参与脓毒症的发生发展[10]。
NLRP3的激活需要两个信号途径，即Toll样受体4(TLR4)途径和ATP依赖的嘌呤受体途径[6]。不同于其他炎性体，NLRP3对病原相关分子模式(PAMP)和损伤相关分子模式(DAMP)刺激十分敏感。NLRP3激活对保护细胞免受病原体侵袭具有重要意义，但过度激活NLRP3可放大炎症反应，加重脓毒症，导致组织损伤、器官衰竭甚至死亡[11]。在不同的PAMP和DAMP刺激后，NLRP3迅速募集ASC和pro-caspase-1，导致Caspase-1活化；活化的Caspase-1可切割IL-1β和IL-18前体，促进其成熟和分泌，活化的Caspase-1还可以激活消皮素D(GSDMD)，诱发细胞焦亡[12]。
脓毒症时，NLRP3的激活可导致肝、肾等器官中中性粒细胞大量浸润；而组织中的巨噬细胞以NLRP3依赖性方式诱导细胞焦亡[13]。有研究发现，当脂多糖(LPS)激活Caspase-11，诱发GSDMD在细胞膜上形成孔洞后，NLRP3也会被激活[14]。细胞内LPS通过Caspase-11刺激IL-1β的成熟和分泌需要Caspase-1、NLRP3和ASC参与，提示胞内LPS刺激的NLRP3激活需Caspase-11作为信号分子参与[15]。用LPS刺激GSDMD敲除的骨髓源巨噬细胞发现，Caspase-1激活和IL-1β成熟过程被显著抑制，表明GSDMD介导了NLRP 3炎性体激活，钾离子外流可能是触发NLRP3激活重要机制[16]。NLRP3在调控炎症反应和脓毒症诱发的器官功能障碍及继发感染中发挥重要作用。因此，深入研究NLRP3激活及其诱导细胞焦亡的机制，对脓毒症的治疗意义重大。
二、非经典炎性体与焦亡非TLR4依赖的机制在LPS诱发的内毒素血症和内毒素休克中具有显著作用[17~19]。Shi等研究发现，LPS能直接结合并激活小鼠Caspase-11诱发细胞焦亡，同时激活NLRP3炎性体，介导IL-1β和IL-18的成熟和分泌，进一步释放DAMPs，如ATP、高迁移率族蛋白1(HMGB1)等，对脓毒症的发展产生重要影响[20]。
Caspase-11炎性体，也称为非经典炎性体，Caspase-11识别LPS在脓毒症病理生理中发挥重要作用，同时Caspase-11激活是LPS诱导死亡的主要途径之一[21]。在LPS或盲肠结扎穿孔(CLP)诱导的脓毒症小鼠模型中，缺乏Caspase-11或GSDMD的小鼠死亡率降低，而NLRP3或IL-1β敲除小鼠不影响大剂量LPS和CLP诱导的脓毒症小鼠的死亡率[22]。这可能与NLRP3的激活仅存在于某些细胞，而Caspase-11介导的细胞焦亡普遍存在有关。例如，肺内皮细胞Caspase-11介导的细胞焦亡促进大剂量LPS和CLP诱发的肺损伤和脓毒症的发生[23]；肠上皮细胞Caspase-11在LPS诱导的脓毒症中加剧组织损伤[24]。
与Caspase-1的激活机制完全不同，Caspase-4/5/11的激活不需要ASC参与，这表明Caspase-4/5/11既是受体也是效应分子[20]。LPS的脂质A部分与Caspase-4/5/11的N-末端半胱天冬蛋白酶激活和募集结构域(CARD)结合并诱发其寡聚化。LPS与Caspase-11的亲和力与LPS和TLR4的亲和力相当，但特异性强[20]。LPS与Caspase-11结合触发Caspase-11寡聚化，诱导Caspase-11激活。Caspase-4/5也可与LPS直接结合并激活，诱发细胞焦亡[20]。经典炎性体通路中的Caspase-1具有与Caspase-11类似的CARD结构域，但因带有电荷，故并不结合LPS。Caspase-4/5/11的CARD区域在等电点条件下的pH大于7，而Caspase-1的pH为6，这可能是Caspase-4/5/11的CARD与LPS脂质A的酸性磷酸基团结合的主要原因[25]。目前，Caspase-11破坏细胞完整性，诱发细胞焦亡和调控炎症反应的具体机制，尚待进一步研究。
三、脓毒症时细胞焦亡相关的关键底物 (一) GSDMDGSDMD是2015年发现的一种属于Gasdermin家族的蛋白，是非典型炎性体Caspase-11的关键和直接靶点。GSDMD含有保守的氨基和羧基末端结构域，静息状态时GSDMD的羧基末端结构域与氨基末端结构域结合而抑制其蛋白酶活性[26]。活化的GSDMD能启动细胞焦亡而激活固有免疫反应，在脓毒症发展中发挥重要作用。有研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术发现，GSDMD是Caspase-1和Caspase-4/5/11的共同底物，活化的Caspase-11将GSDMD切割成N-末端'p30'('GSDMD-N'结构域)和C-末端'p20'('GSDMD-C'结构域)，继而激活GSDMD。GSDMD对Caspase-11介导的IL-1β分泌不可或缺[16]，对细胞焦亡十分重要。同时，NLRP3炎性体激活后，Caspase-1能切割并激活GSDMD，激活的GSDMD对IL-1β释放十分重要[27]。上述研究说明GSDMD在经典和非经典炎性小体激活中均发挥重要作用。
GSDMD-N'对磷酸肌醇和心磷脂具有很强的亲和力，能在细胞膜脂质体上形成具有针孔样结构的寡聚复合体，从而破坏细胞膜的完整性，导致细胞内容物释放到胞外，造成细胞膨胀破裂，诱发细胞焦亡，在脓毒症中发挥重要作用[28]。此外，GSDMD-N'还能激活NLRP 3炎性体，促进Caspase-1活化，进一步促进细胞焦亡[14]。在GSDMD-/-巨噬细胞中，胞内LPS不能诱导激活NLRP3炎性小体。其原因是，GSDMD-N'在细胞膜上形成的孔洞可促进钾离子外流，而细胞膜受损和钾离子外流是NLRP3炎性体活化的重要信号[29]。Shi等证明，使用胞内LPS刺激Caspase-11和激活NLRP3炎性体，GSDMD敲除可明显消除细胞焦亡。在GSDMD-/-的巨噬细胞中，即使存在Caspase-1，IL-1β的分泌也会降低[26]。Caspase-1和Caspase-4/5/11特异性识别GSDMD并裂解氨基端和羧基端之间的肽键是细胞焦亡的核心[30]。GSDMD-/-可抑制LPS诱导的BMDMs细胞焦亡，且LPS刺激后成熟的IL-1β分泌减少。相较于野生型小鼠，GSDMD-/-小鼠在大剂量LPS时死亡率下降，表明GSDMD在细胞焦亡引发的致死性脓毒症和脓毒性休克中的具有重要作用[26]。
(二) 泛连接蛋白-1泛连接蛋白-1(Pannexin-1)是在组织中广泛表达的质膜通道蛋白，它可在细胞膜上形成孔隙通道，允许离子和核苷酸等小分子通过[31]。Pannexin-1是在细胞凋亡过程中释放ATP的关键通道。细胞凋亡时，Caspase-3和Caspase-7通过降解Pannexin-1的C末端抑制部分而将其活化[32]。有研究发现，Caspase-11也可以活化Pannexin-1，表明细胞凋亡和细胞焦亡存在共同底物[33]。在LPS介导Caspase-11活化后，激活的Caspase-11形成寡聚体并切割Pannexin-1的C末端，Pannexin-1活化后可使ATP释放和钾离子外流增加，还可激活ATP敏感的嘌呤能离子通道型受体7(P2X7)，从而促进P2X7依赖性细胞焦亡[33]。另外，Pannexin-1的开放还有助于Caspase-1的活化。在Caspase-11激活后，Pannexin-1可介导IL-1β等炎症因子释放，这可能是由Pannexin-1介导钾外流促进NLRP3炎性体激活所致[34]。在脓毒症小鼠模型中，Pannexin-1基因敲除可降低小鼠死亡率，并且与Caspase-11相关[33]。尽管如此，Caspase-11激活诱发细胞焦亡并导致炎症反应的机制仍不甚清楚，针对Caspase-11调控Pannexin-1的活化及其对P2X7的影响有助于加深对细胞焦亡的认识。
四、展望细胞焦亡是新发现的一种细胞程序性死亡方式。细胞焦亡可抵御病原菌入侵和微生物感染，焦亡过度激活也会加重脓毒症和脓毒性休克。日渐增多的研究增加了学界对细胞焦亡及其信号通路的理解，但其复杂的分子机制及其在脓毒症中的作用有待进一步探索。目前，脓毒症和细胞焦亡的相关研究主要集中于炎性体、GSDMD等分子层面，细胞焦亡在脓毒中的具体作用机制尚不明晰，以细胞焦亡为靶点治疗脓毒症的基础研究还不够深入，距离临床应用还有较长距离。因此，进一步深入研究细胞焦亡的机制及其与脓毒症的关系，将为脓毒症的防护和治疗提供新策略，也将是今后研究的热点和难点。
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