2019, Vol. 3
2. 湘南学院基础医学院病理生理学教研室 湘南学院疾病学基础研究所
2. Department of Pathophysiology, School of Basic Medicine, Xiangnan University; Institute of Basic Disease Sciences, XiangNan University, Chenzhou, China
血管内皮细胞遍布全身，不仅在血液和组织之间充当屏障，而且在炎症反应、免疫调节、凝血与抗凝平衡、血管张力与通透性调节等多方面具有重要作用[1]。脓毒症时，病原体相关分子模式和损伤相关分子模式作用于血管内皮，内皮细胞被激活引起炎症因子和黏附分子释放，内皮的抗凝作用向促凝方向转变，导致机体发生凝血功能紊乱、过度的炎症反应被激活、白细胞趋化、黏附作用增强、血管通透性增加、局部血流发生改变等，炎症因子的释放和凝血功能紊乱以及局部微循环的改变反过来又激活了血管内皮细胞，加速血管内皮的损伤[2]。可见，血管内皮的损伤参与了“全身性炎症反应”、“凝血功能紊乱”、“微循环障碍”等脓毒症的重要发病机制，是脓毒症演变为多器官功能障碍的中心环节，决定了脓毒症的发生发展[3]。因此早期诊断并逆转内皮损伤有利于对抗脓毒症器官损伤[4]。
葛根素是从干燥葛根中提纯的异黄酮化合物，主要有效成分是4, 7-二羟基-8-D-葡萄糖异黄酮[5]。许多研究表明，葛根素具有广泛的抗炎活性和保护血管内皮功能[6~7]。研究发现，葛根素可以通过抑制炎症反应而阻止糖尿病心肌病变[6]。葛根素可以降低肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激的人内皮细胞中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)，血管细胞间黏附分子-1(VCAM-1)和E-选择素(E -selectin)的表达[8]。此外，葛根素可以减弱脂多糖(LPS)诱导的心肌细胞中IL-1和TNF-αmRNA的表达[9]。葛根素能否对抗脓毒症导致的血管内皮损伤进而改善脓毒症器官功能尚不清楚。LPS为革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，给动物注射LPS可以引起内毒素血症，其表现类似脓毒症反应[10]。本实验中，我们旨在观察葛根素抗内毒素血症小鼠血管内皮细胞损伤的作用及其机制，因此，观察葛根素对LPS所致内毒素血症小鼠血清中炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)，黏附分子(ICAM-1，VCAM-1和E-selectin)水平的影响，并探讨葛根素抗LPS诱导的内皮细胞损伤能否改善内毒素血症肺功能，从而为临床上脓毒症的防治提供新的思路与手段。
资料和方法 一、材料 (一) 动物SPF级BALB/C小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，雄性，18~22克，动物生产许可证号SCXK(湘)2016-0002。饲养于符合动物饲养环境和条件的标准实验室，每笼5只，动物适应性饲养1周后开始实验，按医学伦理学标准处置动物。
(二) 药物和试剂葛根素购自Sigma公司，LPS购自上海翊圣生物科技有限公司，TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1、VCAM-1和E-selectin ELISA试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司。
(三) 仪器酶标检测仪(BioTeK Epoch)，显微镜(德国Leica)，切片机(德国1512型)，小动物麻醉机(美国Edan Direct公司)，离心机(德国Eppendorf公司)，电子天平(上海佑科有限公司)，脱水机和包埋机(武汉俊杰电子有限公司)。
二、方法 (一) 分组、给药及造模18只小鼠随机分成三组，正常对照组5只，按0.1mL/10g腹腔注射生理盐水，连续注射4天。LPS组7只，按0.1mL/10g(5mg/kg)腹腔注射LPS，第4天给药，只给一次。葛根素组6只，按0.1mL/10g(50 mg/kg)腹腔注射葛根素，连续注射4天，第4天注射葛根素后半小时注射LPS 0.1mL/10g (5mg/kg)。24 h后收集标本。
(二) 血清收集小鼠麻醉后眼球静脉取血，室温下血液自然凝固10~20min后3 000转/min离心20min后取上清。
(三) ELISA检测按ELISA试剂盒说明书测血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6，黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的水平。
(四) 肺组织病理学观察和湿干重比计算小鼠左肺用4%甲醛固定后石蜡包埋切片，然后进行伊红苏木素(HE)染色。小鼠右肺用滤纸吸干其表面血液和水，称重(W)，置70℃烤箱烘干72h至恒重后再次称重(D)，然后计算肺组织湿干重比(W/D)。
三、统计学方法计量资料采用均值±标准差(x±s)表示，统计分析和图形绘制采用GraphPad Prism 6软件。多组间比较用One-way ANOVA分析，各组间差异的两两比较用Student-Newman-Keuls检验。双侧P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 一、葛根素降低内毒素血症小鼠炎症因子TNF-α和IL-1β以及黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的水平与正常对照组相比，LPS组小鼠血清炎症因子TNF-α和IL-1β明显升高，黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin含量增加，IL-6变化不明显；而用葛根素预处理4天再腹腔注射LPS，小鼠血清中炎症因子TNF-α和IL-1β明显下降，黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin明显减少，IL-6变化不明显(图 1)。可见，葛根素具有降低内毒素血症小鼠血清中炎症因子和黏附分子的作用。
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图 1 葛根素对内毒素血症小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6以及黏附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的影响(x±s, n=5-7) * P < 0.05, **为P < 0.01与正常对照组比，# P < 0.05, ##为P < 0.01与LPS组比 |
正常对照组肺组织内肺泡腔完整清晰，肺泡间隔无水肿和炎症细胞浸润(图 2)。与正常对照组相比，LPS组肺间质增宽，大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润(图 2)，肺湿干重比增加(图 3)。与LPS组比，葛根素组肺间质增宽程度明显减轻，炎症细胞浸润减少，肺湿干重比降低(图 2和3)。由此可见，葛根素减轻了内毒素血症肺损伤。
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图 2 葛根素减轻内毒素血症小鼠肺组织损伤(HE, ×200) |
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图 3 葛根素降低内毒素血症小鼠肺组织的W/D (x±s, n=5-7)**为P < 0.01与正常对照组比，##为P < 0.01与LPS组比 |
脓毒症时，病原体及其毒素作用于血管内皮，导致血管内皮细胞激活并引起炎症因子TNF-α和IL-1β以及黏附分子ICAM-1和VCAM-1等的释放，炎症因子反过来又损伤血管内皮，黏附分子促进白细胞与内皮细胞的相互作用，两者共同加速炎症因子的释放和黏附分子的表达，致使血管内皮通透性增加并促使炎症细胞游出血管外[11]。俞等报道，大鼠经盲肠结扎穿刺术后72h，血清中sICAM-1和vWF的水平明显升高，而辛伐他汀处理后sICAM-1和vWF的水平明显降低，血管内皮损伤得以改善[12]。王等发现LPS所致内毒素血症大鼠血液中ICAM-1、VCAM-1、Ang-2和vWF的含量明显升高，而罗格列酮处理后，血液中ICAM-1，VCAM-1，Ang-2和vWF的含量降低，血管内皮细胞损伤减轻[13]。人脐静脉内皮细胞在受到LPS刺激后培养液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显升高，葛根素作用后TNF-α、IL-1β和IL-6水平下降，内皮细胞损伤也得到改善[14]。本实验发现，在LPS注射24h后的内毒素血症小鼠血清中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的含量明显高于正常对照组，同时血清中TNF-α和IL-1β也处于较高水平，这表明血管内皮细胞被激活并导致过度的炎症介质和黏附分子的释放，进一步导致内皮功能障碍。同时，本实验中发现LPS注射24h后，肺间质增宽，大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润，肺湿干重比增加。可见LPS损伤了肺血管内皮细胞，导致炎症细胞浸润和大量液体渗出以致肺水肿。
葛根素是一种异黄酮化合物，具有扩张冠状血管、改善心肌代谢、抗氧化、抗炎活性和保护血管内皮功能、改善微循环等作用[15], 临床广泛用于心脑血管疾病的治疗。最近有学者研究发现葛根素能抑制不稳定型心绞痛患者血小板活化、改善纤溶活性及减轻炎症反应[16]，改善脓毒症大鼠凝血功能紊乱[17]；葛根素还能降低动脉粥样硬化兔粘附分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin表达[18]；减轻脂多糖诱导的心肌细胞炎症因子IL-1β和TNF- αmRNA表达[9]。本实验室已经研究发现葛根素可以对抗糖基化终末化产物以及溶血性磷脂酰胆碱对血管内皮的损伤[7, 19]。本实验主要观察葛根素能否对抗LPS诱导的内毒素血症血管内皮损伤。给予50mg/kg葛根素预处理4天，内毒素血症小鼠血清中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin以及TNF-α和IL-1β的含量显著降低，表明葛根素可降低内毒素血症小鼠炎症因子和黏附分子等的释放，改善LPS诱导的血管内皮细胞损伤。葛根素预处理后肺间质增宽程度下降，中性粒细胞和淋巴细胞浸润减少，肺湿干重比降低。可见，葛根素减弱了LPS诱导的肺血管内皮细胞损伤，使肺组织炎症细胞浸润和液体渗出减少以致改善肺功能。
总之，在LPS诱导的内毒素血症模型中，葛根素可通过抑制血管内皮细胞黏附分子与炎症因子的分泌从而缓解血管内皮的损伤，并进一步改善了内毒素血症小鼠肺功能。
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