脓毒症(sepsis)是由感染引起的、能够危及生命的、以器官功能障碍为表现的临床综合征，是ICU患者最主要的死因^[1]。过度炎症反应、免疫及凝血功能紊乱是脓毒症的核心病理机制，导致脓毒症多种并发症的发生。血小板是脓毒症时机体炎症、免疫及凝血反应的重要效应细胞，能够参与识别病原体及病原相关分子模式(PAMPs)、黏附并活化白细胞、释放炎症因子、促进凝血反应等过程，加重脓毒症宿主反应紊乱，引起多器官功能障碍^[2]。白细胞介素18(IL-18)是一种在体内广泛分布的促炎因子，进而能够诱导干扰素(IFN)-γ的产生，在感染及炎症的起始免疫反应中具有重要的调控作用^[3]。脓毒症时，患者外周血IL-18表达量显著升高，且与疾病严重程度及预后密切相关^[4]。有研究表明，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染时，血小板能够释放IL-18，进而加重疾病病情^[5]。但脓毒症时血小板与IL-18的释放是否相关，目前还不清楚。本研究拟制备脓毒症大鼠模型，初步探究脓毒症大鼠体内血小板与IL-18释放的相关性。

本研究已获天津市第一中心医院实验动物管理委员会批准。雄性SD大鼠78只，质量为190~210 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2014-0001。先将大鼠置于标准条件下(室温18-22℃，相对湿度60%~80%，自然光照明，标准大鼠动物饲料喂养，自由进食、饮水)饲养1周以适应环境。根据体重由轻到重编号，采用随机数法将78只雄性SD大鼠随机分为12小时假手术组、12小时模型组、24小时假手术组、24小时模型组、48小时假手术组和48小时模型组，每组12只；另有6只健康大鼠取血后作体外观察用。

Synergy 2全功能酶标仪(Biotek公司)；FACSAria Ⅱ流式细胞仪(BD公司)；大鼠白细胞介素18(IL-18)酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒购自武汉博士徳生物科技有限公司；大鼠别藻青蛋白(APC)-抗白细胞分化抗原61(CD61)及藻红蛋白(PE)-抗CD62P流式抗体购自Biolegend公司；枸橼酸钠抗凝管(美国BD医疗器械有限公司)；称量2 g柠檬酸钠、1.5 g柠檬酸、2.5 g葡萄糖溶于100 ml双蒸水(ddH₂O)充分混匀，0.22 um孔径滤器过滤除菌，制成枸橼酸钠葡萄糖(ACD)抗凝液，4℃保存备用。

依据参考文献^[6]，采用盲肠结扎穿孔法(CLP)制备大鼠脓毒症模型，具体步骤：按0.6 ml/100 g体重予5%水合氯醛腹腔注射以麻醉；待夹趾无反应后，将大鼠腹部朝上固定于手术台上；腹部备皮并碘伏消毒后，用手术剪沿前正中线在上腹部皮层和肌层分别剪一长约2.5 cm切口，用手术镊小心夹出盲肠，置于37℃生理盐水淋湿的纱布上，分离肠系膜，4号缝合线结扎盲肠远端1/2，避开肠系膜血管；用棱长3 mm的三棱针在结扎远端刺穿盲肠，轻轻挤压使少量肠内容物从穿孔漏出，用棉签擦去漏出的肠内容物并将盲肠纳回腹腔；用缝合线分别缝合腹壁肌层和皮层，去固定，从大鼠颈后皮下注入10 ml 37℃生理盐水。假手术组大鼠不结扎盲肠及穿孔，其他操作同模型组。

在各时间点麻醉相应大鼠，腹主动脉取血，ACD按1:6抗凝。取1 ml ACD抗凝血，1000 g 10 min离心，取上清300 ul分装冻存于-80℃。参照大鼠IL-18 ELISA检测试剂盒说明书，检测大鼠血浆IL-18的浓度。

将剩余的ACD抗凝血200 g 20 min离心；取20 ul PRP与65 ul生理盐水、15 ulACD混匀；分别加入5 ul APC-抗CD61和PE-抗CD62P流式抗体，避光孵育15 min；加入100 ul 4%多聚甲醛，避光固定10 min；加入1 ml生理盐水稀释，1000 g 10 min离心，轻轻弃去上清；500 ul 1%多聚甲醛重悬血小板沉淀。用流式细胞仪检测CD61⁺细胞中CD61⁺CD62P⁺细胞的百分比。

将6只健康雄性SD大鼠麻醉后经腹主动脉取血，枸橼酸钠真空采血管抗凝，200 g 20 min离心，轻轻吸上1/2的PRP，分成两份，其中一份1000 g 10 min离心，-80℃保存上清；另一份加入LPS使终浓度为100 ng/ml，静置6h后1000 g 10 min离心，-80℃保存上清。按前述方法检测上清中IL-18的表达水平。

用IBM SPSS Statistics 22对结果进行统计，两组间独立样本的计量资料在正态分布时采用两独立样本t检验比较均值，结果用均数±标准差表示；两组间配对样本的计量资料在正态分布时采用配对t检验比较均值，结果用均数±标准差表示，在非正态分布时采用秩和检验。用Flowjo X10.0.7分析流式细胞术结果。用Graphpad Prism 7制作统计图。

在盲肠远端1/2被结扎后，大鼠逐渐出现状态萎靡、活动减少、体温减低、大便不成形；18小时后CLP模型大鼠开始出现死亡；解剖大鼠腹部后见腹腔内有大量腹水、肠腔胀气、肠壁水肿。假手术组大鼠状态较好，活动量正常，观察时间段内未出现死亡，腹腔内部明显腹水，无肠腔胀气及肠壁水肿。以上现象表明大鼠CLP模型制备成功。

按结扎制备CLP大鼠模型后，在相应时间点采集大鼠血浆样品，检测IL-18表达水平。各观察时间点CLP组大鼠血浆IL-18表达水平均显著高于sham组大鼠(12 h: t=4.049, P < 0.01; 24 h: t=5.976, P < 0.0001; 48 h:t=4.242, P < 0.001)。

图 1(Figure 1)

图 1 CLP大鼠血浆IL-18表达水平(n=8)

采集大鼠富血小板血浆，检测血小板活化程度。各观察时间点CLP组大鼠的血小板活化率均高于sham组大鼠(12 h: t=4.055, P < 0.01; 24 h: t=4.497, P < 0.01;48 h:t=3.226, P < 0.01)。

图 2(Figure 2)

图 2 模型组大鼠血小板活化率显著升高(n=6)

为观察血小板是否能释放IL-18，取大鼠PRP后予LPS刺激，观察上清中IL-18表达水平。LPS刺激后，PRP中IL-18表达水平较未刺激前显著增加，差异有统计学意义(n=6，t=4.837，P < 0.01)。

图 3(Figure 3)

图 3 LPS刺激6h后PRP中IL-18表达水平显著升高(n=6)

脓毒症是ICU住院患者的主要死因之一，给社会带来了沉重的疾病和经济负担^[7]。过度炎症反应及免疫紊乱是脓毒症发病的中间环节和重要病机，导致了脓毒症的严重病情和不良预后。在PAMPs及损伤相关分子模式(DAMPs)的诱导下，包括巨噬细胞在内的多种细胞分泌IL-18，进而发挥促炎因子的作用，激活核转录因子(NF)-κB、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等转录因子，调控IFN-γ等炎症因子的转录、翻译及释放，进一步发挥促炎、调节免疫的作用^[3]。Oberholzer A等研究表明，脓毒症患者的血浆IL-18表达水平较烧伤患者及健康人更高，而脓毒症休克及预后不佳的脓毒症患者伴随更高水平的血浆IL-18^[4]。Yamada T等也发现，ICU住院患者中不能存活患者的血浆IL-18表达水平显著高于存活者，且血浆IL-18表达水平与患者APACHE Ⅱ评分密切相关^[8]。本研究中，脓毒症模型大鼠血浆IL-18表达水平较假手术组显著升高，尤以24h升高最为明显，与Yamashita H等观察到的结果较为一致。但本实验中IL-18表达水平较文献报道偏低，可能与实验用动物的种属不同及检测试剂生产厂商不一致有关^[9]。

血小板活化是脓毒症的特征之一。脓毒症时，多种因素激活凝血反应，促使大量凝血酶的合成；PAMPs及多种炎症因子活化血管内皮，暴露内皮下胶原，促使内皮合成大量假性血管性血友病因子(vWF)和组织因子(TF)。凝血酶、PAMPs、内皮下胶原、vWF、TF及细菌均能诱导血小板活化^[2]。本研究中，脓毒症模型大鼠血小板表面的活化标志物P选择素的表达水平较假手术组大鼠显著增加，与既往文献报道一致^[10]。活化的血小板与中性粒细胞发生黏附，进而促进其组织浸润及中性粒细胞细胞外陷阱(NET)的形成，辅助机体对入侵病原体的清除与限制。与此同时，活化的血小板还能够通过促进微循环血栓的形成、加剧机体炎症反应等途径促使器官功能障碍的发生，引起脓毒症器官功能不全。

血小板虽然是无核细胞，不携带基因组，但其拥有信号依赖的剪接及翻译功能，能够将来自巨核细胞的前体信使核糖核酸(pre-mRNA)剪接成成熟的mRNA，并由粗面内质网及核糖体将其翻译成相应的蛋白质^[11-13]。此外，血小板还含有炎症小体等蛋白修饰机制，能够将pre-IL1β、pre-IL-18等前体蛋白修饰成活性蛋白后释放出胞外，参与宿主反应^{[5, 14]}。Allam O等发现，在凝血酶等血小板激活剂的刺激下，人血小板能够合成并释放IL-18^[5]。本实验结果表明，大鼠血小板在LPS刺激下也能够释放IL-18。这进一步提示，在脓毒症模型大鼠体内，多种因素促使血小板活化率增加，可能伴随血小板合成和释放IL-18增加，进而参与引起血浆IL-18表达水平升高及后续炎症反应的进一步加剧。

综上所述，脓毒症模型大鼠体内血小板活化显著增加，并可能与血浆IL-18的表达增加相关。