2017, Vol. 1
近年来尽管对脓毒性休克的认识和治疗进展方面取得了很大成就，但脓毒性休克依然具有很高的发病率和病死率, 并且经常出现多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[1]。液体复苏是改善脓毒性休克有效循环血容量不足和降低多器官功能障碍综合征发生率的重要手段。大量临床试验已经证实早期液体复苏能明显改善脓毒性休克患者的预后[2-3]。然而液体复苏本身是一把双刃剑，在改善有效容量的基础上，也存在液体过负荷所导致的间质水肿及其随后可能发生的器官功能损伤的风险[4]。因此如何有效实施液体复苏成为影响脓毒性休克患者预后的重要因素。
脓毒性休克时由于外周血管张力下降，有效循环血容量急剧下降，微循环障碍、心脏功能抑制从而导致急性循环衰竭，是危重症患者死亡的主要原因之一[5]。研究发现，心肌损伤是脓毒症的常见并发症，发生率约50%[6]。在此过程中，炎性介质级联反应、心肌细胞凋亡是造成心肌抑制的重要原因[7]，因此研究脓毒性休克及液体复苏过程中心肌细胞损伤情况以及寻求更优化的液体复苏方案显得尤为迫切。
氢分子作为一种选择性的抗氧化剂，在多种疾病的动物模型中均表现出很好的治疗效果[8]。氢分子的作用机制主要包括选择性抗氧化、抑制凋亡和过度的炎症反应。作者以前研究发现联合2%氢气吸入的液体复苏方案对脓毒性休克所致的急性肺损伤具有明显的保护作用[9]，因此本实验将再次利用脓毒性休克大鼠模型，探究联合2%氢气吸入早期液体复苏方案对脓毒性休克大鼠心肌损伤的治疗效果及相关机制。
材料和方法 (一) 材料 1. 动物60只健康雄性Wistar大鼠(180~200 g)随机分成4组，正常对照组(C组，n=15)、脓毒性休克对照组(S组，n=15)、液体复苏组(R组，n=15)和液体复苏+2%氢气吸入组(R+H2组，n=15)。所有动物均由中国医科大学实验动物部提供，并在清洁级动物房饲养繁殖。
2. 主要仪器HX300动物呼吸机，HP便携式心电监护仪，OMNI血气分析仪(瑞士AVL公司)，光学显微镜(日本Olympus公司)。
3. 主要试剂脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)(Sigma，L-2880 from E.coli serotype O55:B5)；丙二醛(malonaldehyde1，MDA)、超氧化物歧化酶(superroxide dismutase，SOD)及髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；2%氢气、21%空气和77%氮气混合气体由中国医科大学医用气体站提供。
(二) 方法 1. 动物模型制作10%水合氯醛(300 mg/kg)经腹腔麻醉，气管切开接呼吸机辅助通气，呼吸频率100次/min，潮气量10 mL/kg，R+H2组吸入气体为2%氢空混合气，其余3组吸入气体为空气。左颈动脉穿刺，连接监护仪监测心率及平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)；股静脉穿刺留置导管，以备给药及补液，电热器维持体温。大鼠状态稳定30 min后，除C组外，其余3组LPS10mg/kg(配制浓度10 mg/mL，推注时间不少于2 min，推注完毕再推入0.2 mL生理盐水将注射器内残存的LPS完全注入)缓慢静脉注射，建立脓毒性休克大鼠模型。C组静脉注入等量生理盐水。液体复苏方案:生理盐水10 mL/kg/15 min，30 min后根据MAP水平，应用去甲肾上腺素(0.5~6 μg/kg/min)，维持MAP于正常水平[10]。记录各组的生命体征、补液量及去甲肾上腺素的用量。所有大鼠于模型建立成功4 h后经颈动脉放血处死，留取动脉血1 mL行血气分析，剩余血液3 000 g离心10 min，留取血清行心肌钙蛋白I (cTnI)的检测。开胸取出心脏，PBS冲洗后切取左室游离壁心肌，一块以4%多聚甲醛固定，留作光镜检测，剩余-80 ℃保存留作检测氧化还原指标及炎性介质水平。
2. 心肌钙蛋白I (cTnI)的检测上述实验结束时收集血清标本, 血清cTnI用Stratus CS cTnI荧光标记酶联免疫法(Dade Beh ring)测定, 参照说明书进行操作。
3. 心脏组织病理学观察心肌组织以4%多聚甲醛浸泡24 h以上，常规脱水、包埋，切成4 μm切片，用苏木素伊红(HE)染色，光镜下观察心脏组织病理改变。
4. 心脏组织中MDA、MPO、SOD活力的测定取心肌组织匀浆，12 000 g离心20 min，取上清液采用分光光度法测定MDA、MPO、SOD活性，严格按照说明书操作。
5. 心脏组织中炎性介质检测将冻存的心肌组织在冰上解冻、匀浆，4℃离心(3 000 g，15 min)，ELISA检测TNF-α和IL-6(严格按说明书操作)。
(三) 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果 (一) MAP、PO2补液量及去甲肾上腺素的用量本实验中MAP在静脉注射LPS后20 min降至正常的80%，R组和R+H2组在整个实验过程中MAP值无明显差异。R+H2组液体量和去甲肾上腺素用量明显少于R组。PO2在S组明显降低，两种液体复苏方案均使PO2升高，但R+H2组升高的更为明显(P＜0.05，表 1)。
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表 1 各组MAP、PO2、补液量及去甲肾上腺素用量的比较 Table 1 MAP, PO2, fluid volume and norepinephrine usage in different groups (Mean±SD. n=15) |
S组与C组比较，血清cTnI水平明显升高，两种液体复苏方案明显降低了血清cTnI水平，但R+H2组降低的更为明显(P＜0.05，图 1)。
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图 1 各组血清cTnI表达水平的比较 Figure 1 The levels of cTnI in different groups. Mean±SD. n=15. * P < 0.05 vs group C; △ P < 0.05 vs group S; # P < 0.05 vs group R. |
C组光镜下见正常排列的心肌细胞，S组心肌纤维明显水肿和无序排列，心肌纤维横纹模糊不清、间质水肿伴炎性细胞侵润。R组和R+H2组光镜下心肌细胞损伤明显减轻，尤其是R+H2组(图 2)。
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图 2 心脏组织的HE染色 Figure 2 The images of heart tissues with HE staining (×400) in different groups. |
S组与C组比较，MDA、MPO水平明显升高伴随SOD明显下降，液体复苏后MDA、MPO表达明显下降伴随SOD升高，但此变化趋势在R+H2组更为明显(图 3A-C)。
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图 3 各组MPO(A)、MDA(B)和SOD(C)水平的变化。 Figure 3 The changes of MPO (A), MDA (B) and SOD (C) in the heart tissues of different groups. Mean±SD. n=15. *P < 0.05 vs group C; △P < 0.05 vs group S; #P < 0.05 vs group R. |
ELISA检测结果显示S组心脏组织的TNF-α和IL-6表达与C组比较明显升高，液体复苏后TNF-α和IL-6表达明显下降，R+H2组与R组比较下降得更为明显(P＜0.05，图 4A，B)
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图 4 心脏组织TNF-α(A)、IL-6(B)在各组的表达变化。 Figure 4 The expression levels of TNF-α (A), IL-6 (B) in the heart tissues of different groups. Mean±SD. n=15. * P < 0.05 vs group C; △ P < 0.05 vs group S; # P < 0.05 vs group R. |
本实验结果提示联合2%氢气吸入的液体复苏方案与单纯液体复苏比较，显著降低维持正常MAP所需的液体及去甲肾上腺素用量。既优化了氧合、减轻了单纯液体复苏可能导致的液体过量的弊端，又减少了大量去甲肾上腺素对冠状动脉的收缩作用，从而更大的优化了脓毒性休克液体复苏的治疗效果。
本实验结果显示脓毒性休克诱导了明显的心肌损伤，光镜下可见心肌纤维肿胀、无序排列及炎性细胞侵润。cTnI是目前临床上常用的反映心肌损伤的生化标志物。cTnI在缺血性心肌损害中被认为是最敏感和最特异的心肌标志物，亦可以用来评价脓毒症患者心肌损伤程度和左室功能，可以预测脓毒症的预后[11]。本实验中脓毒性休克对照组大鼠血清中cTnI明显升高，两种液体复苏方案均使cTnI水平下降，但联合氢气吸入的液体复苏方案使血清中cTnI下降更为明显。因此心肌病理和血清中cTnI表达水平变化均提示联合氢气吸入的液体复苏方案对脓毒性休克所致心肌损伤具有更好的保护作用。
在脓毒症时，LPS激活中性粒细胞、巨噬/单核细胞及内皮细胞等，释放大量炎性介质同时产生大量活性氧族(reactive oxygen species, ROS)，液体复苏过程中，微循环经历缺血后再灌注也产生大量ROS，后者从很多方面对脓毒性休克患者的预后产生负面影响[3]。因此改善氧合和降低氧化应激损伤对保护脓毒性休克所致心肌损伤至关重要。本实验结果显示，联合氢气吸入的液体复苏方案与单纯液体复苏比较，不仅明显提高了血气氧分压的水平，还使MPO、MDA表达明显下降，SOD表达明显升高，提示联合氢气吸入的液体复苏方案不仅显著改善了机体氧合，还明显降低了氧化应激损伤，对脓毒症所致心肌损伤具有显著的改善作用。
虽然脓毒性休克所致急性心肌损伤具体机制仍不十分清楚，但过度炎症反应在此过程中扮演重要角色[12]。研究表明脓毒性休克时侵入心肌组织的炎性细胞释放大量炎性细胞因子和心肌抑制因子，同时损伤的心肌细胞本身亦可释放促炎介质，其中TNF-α在此过程中扮演重要角色，大量TNF-α释放起到明显损伤心肌细胞的作用[13]。TNF-α的过度释放进一步促进下游炎性介质如IL-6的过度释放，从而形成炎性级联反应，加重心肌细胞的损伤。本实验中，脓毒性休克组TNF-α和IL-6表达明显升高，提示过度炎症反应参与脓毒性休克心肌损伤的发病过程，两种液体复苏方案均明显降低了TNF-α和IL-6的表达，但在联合氢气的液体复苏组降低的更为明显。因此本实验结果提示联合氢气的液体复苏方案与单纯液体复苏比较，进一步降低了促炎介质的表达，对脓毒性休克所致的心肌损伤更具保护作用。
脓毒性休克过程中，微循环或毛细血管功能障碍直接影响液体复苏的效果。毛细血管透过度增加导致渗漏致组织间隙的液体增加，导致器官水肿和有效循环血容量的不足，最终进一步加重器官缺血、缺氧和持续的低血压。早期液体复苏是治疗脓毒性休克的重要手段，但是如果治疗不当，复苏所用液体会导致器官水肿加重和器官功能衰竭。氢分子因为具有抗氧化、抑制凋亡和过度炎症反应的作用，在液体复苏过程中可能通过改善毛细血管的功能，减少了渗漏至组织间隙的液体量，因而更加优化了液体复苏积极的治疗效果，而减少了液体过量所致的弊端，对脓毒性休克所致心肌及其他脏器功能障碍具有更好的治疗效果。
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