凤眼莲(Eichhornia crassipes)是我国外来入侵物种之一, 在各类水体中泛滥成灾, 其具有纤维素、半纤维素含量高, 生长不占用土地等优点, 是能源产品生产的重要生物质来源^[1-3]。生物质原料结构复杂, 其主要利用对象是构成植物细胞壁的原纤维丝。木质素、半纤维素和果胶等基础物质相互交联包裹，组成坚固的原纤维丝表层结构, 使得纤维素成分难以被利用^[4-5]。如何高效释放出生物质原料中能被发酵阶段利用的糖进而提高乙醇等能源物质的生产效率，成为目前生物质能源化利用中最大的技术与经济挑战^[6-8]。预处理是生物质原料释放可利用糖的关键步骤, 其目的是破坏原纤维丝顽固的外表层结构, 尽可能增大后续酶水解对结晶纤维素的可及度, 从而提高生物质利用效率^[9-11]。生物脱胶是生物质利用的预处理方法之一, 其机理是通过特殊微生物对环境的适应性, 分泌果胶酶及半纤维素酶等酶系, 将大分子的果胶及半纤维素转化为小分子的生物可利用糖, 进而被脱胶菌株吸收利用^[12]。目前脱胶菌多用于对苎麻的研究, 通过去除麻类物质中的胶质成分同时保留其纤维成分, 增强麻类纤维性能, 这种脱胶方法鲜有涉及其他类型植物^[13]。笔者借鉴前人对苎麻脱胶菌的筛选方法, 从凤眼莲不同生长环境中筛选降解凤眼莲非纤维素的优良菌株, 并对其产酶特性和脱胶能力进行了探究。目前报道的脱胶菌株有放线菌属^[14]、纤维单胞菌^[15]、志贺菌属^[16]和枯草芽孢杆菌^[17]等, 这些都是对麻类的脱胶菌株, 而对解淀粉芽孢杆菌脱胶报道较少。该研究报道了一种解淀粉芽孢杆菌作为凤眼莲脱胶菌的效果，解淀粉芽孢杆菌本身也可以消耗蛋白质、脂肪和淀粉等有机物。具有果胶酶活性的解淀粉芽孢杆菌可以有效去除木质纤维素中的蛋白质和胶质成分，为生物预处理凤眼莲提供生物基础。

1 材料与方法 1.1 菌种来源与材料制备

选取华中农业大学某生长凤眼莲的池塘水、池塘底泥和武汉南湖湖水分别作为菌种来源。选用华中农业大学周边随机采摘的健壮凤眼莲植株, 洗净晾干, 并将其根、叶与茎切离, 将茎切成约2 cm小段, 烘干备用。

分离培养基Ⅰ:w=0.01%的K₂SO₄ 0.1 g, CaCl₂ 0.2 g, NaCl 0.2 g, MgSO₄·7H₂O 0.3 g, KNO₃ 0.5 g, (NH₄)₂SO₄ 0.5 g, K₂HPO₄ 1 g, 琼脂20 g, 蒸馏水1 L; 分离培养基Ⅱ:果胶1 g, 琼脂5 g, pH值为7.0, 蒸馏水1 L。在培养皿中倒双层平板, 表层为5 mL培养基Ⅱ, 基层为10 mL培养基Ⅰ。

水解圈测定培养基Ⅰ:FeSO₄ 0.01 g, CaCl₂ 0.2 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, NaCl 0.5 g, KH₂PO₄ 1 g, NH₄NO₃ 3 g, 果胶5 g, 琼脂20 g, pH值为7.0, 蒸馏水1 L; 水解圈测定培养基Ⅱ:20 g琼脂, 蒸馏水1 L。在培养皿中倒双层平板, 表层为10 mL培养基Ⅰ, 基层为10 mL培养基Ⅱ。

脱胶培养基^[18]:凤眼莲茎5 g, 盐溶液150 mL, pH值约为7.0。盐溶液:MgSO₄·7H₂O 0.5 g, K₂HPO₄ 0.5 g, (NH₄)₂SO₄ 5 g, 无菌水1 L。

斜面培养基:牛肉膏蛋白胨固体培养基。

1.2 菌种的分离与筛选 1.2.1 菌种的分离与纯化

设置5个处理, 编号为A、B、C、D和E, 处理设置见表 1。取凤眼莲茎样和水, 按m(固):V(液)=1:30的比例置于锥形瓶中, 自然pH下(pH值约为7.0)35 ℃培养至纤维分散(约5 d), 得一次增殖培养液。另取凤眼莲茎, 同上处理加入一次增殖培养液, 得二次增殖培养液。取二次增殖培养液1 mL, 分别稀释10^-5、10^-6和10^-7倍。分别取0.1 mL不同浓度稀释液于分离培养基中涂布, 35 ℃恒温培养2~3 d。挑选分离培养基中得到的菌群, 于斜面培养基上划线纯化、保存。

1.2.2 初筛

将上述分离得到的菌株点接于水解圈测定培养基, 35 ℃培养2 d。采用刚果红平板染色法, 计算水解圈直径(H)与菌落直径(C)之比, 即H/C比值^[19]。H/C比值较大的菌株即为初筛菌株。

1.3 酶活性测定

将初筛得到的菌株置于脱胶培养基中培养, 测定果胶酶、木聚糖酶及纤维素酶活性。脱胶培养条件:温度35 ℃，振荡速率145 r·min^-1，接种率4%，pH值7.0。每24 h取2 mL发酵液, 用DNS比色法测定果胶酶、木聚糖酶及纤维素酶活性^[20]。

1.4 脱胶试验

分别将复筛菌株接种于脱胶培养基中, 在最佳脱胶条件下培养。脱胶完成后取出样品, 用蒸馏水洗净后烘干称重, 计算样品的脱胶率, 可用减重率表示^[21]。再次按上述步骤连续脱胶2次(共计脱胶3次)。减重率=(M₀-M₁)/M₀×100 %。式中，M₀为脱胶处理前样品干重, g；M₁为脱胶处理后样品干重，g。

1.5 菌株的鉴定 1.5.1 革兰染色及菌株16S rRNA基因测序

将筛选得到的脱胶最优菌株A₁进行革兰染色后^[22], 于显微镜下观察其形态特征。另取1支A₁菌种管委托武汉擎科测序公司进行16S rRNA测序。

1.5.2 系统发育分析

分离菌株测序结果提交GenBank进行BLAST比较, 从BLAST结果中挑选与该菌株碱基序列相似度在95%以上的菌株序列, 通过Clustal W进行多重序列比对, 并利用MAGE 6.0软件, 以Neighbor-Joining法构建系统发育树。

2 结果与讨论 2.1 初筛结果

将经过富集培养、分离所得的优势菌群用于凤眼莲脱胶菌的初次筛选, 得到产生黄色透明圈的15株菌株。由表 2可知, A₁、B₃、B₁₁和C₁₁这4支菌株不是该分离培养基上最具优势的菌株, 但它们的水解圈直径均大于45 mm, 其菌落所产生的透明圈明显大于其他菌株, 故选择透明圈较大及H/C比值较高的5株菌株A₁、B₃、B₁₁、C₁₁和B₁₃用于复筛。

2.2 酶活性测定

将上述5支菌株复筛, 其酶活性变化见图 1。

5支菌株分泌的果胶酶和木聚糖酶活性先升高再降低, 纤维素酶活性在培养48~72 h时均呈明显降低趋势, 再随着时间的延长纤维素酶活性又有所回升。A₁、B₃和B₁₁菌株的果胶酶和木聚糖酶活性分别在48和72 h达到最高值, 木聚糖酶活性的最大值出现时间有一定的滞后性; C₁₁和B₁₃菌株的果胶酶与木聚糖酶活性在72 h达到最高值。上述现象可能是因为凤眼莲样品经物理破碎以及灭菌过程, 部分木质纤维素成分溶入发酵液中, 促使细菌产生纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶以进行自身的发酵。当溶液中的纤维素和木聚糖等消耗后, 细菌开始利用凤眼莲外部的胶质成分, 此时纤维素成分浓度较低, 进而表现为果胶酶和木聚糖酶活性增加, 而纤维素酶活性降低。而当胶质结构被破坏后, 部分纤维素成分暴露出来, 使得纤维素酶活性又有所增加。在72 h时纤维素酶活性基本处于最低水平, 此时果胶酶与木聚糖酶活性较高。因此, 选定72 h作为最佳脱胶周期。

经过72 h脱胶后, 测得A₁、B₃、B₁₁、C₁₁和B₁₃这5支菌株分泌的3种酶活性见表 3。A₁菌株分泌的3种酶活性均较高, 其木聚糖酶活性明显高于其他菌株。脱胶效果主要可通过果胶酶活性与木聚糖酶活性来表征, 这2种酶活性越高, 脱胶效果越显著。A₁菌株纤维素酶活性虽然在5种菌株中最高, 但绝对数值较低, 且与其他菌株(B₁₁菌株除外)相比差异不显著。

2.3 脱胶效率比较

选取A₁、B₃、B₁₁、B₁₃和C₁₁这5支菌株进行凤眼莲脱胶试验, 经过1次脱胶后, 凤眼莲纤维在不同菌株作用下的分散程度不同, A₁菌株处理后的凤眼莲茎纤维状较其他菌株更加明显, 部分茎已成丝状, 其纤维释放效果明显优于其他菌株。

将凤眼莲连续脱胶3次, 计算3次脱胶的累计减重率, 结果见图 2。A₁菌株第1次脱胶的减重率显著高于其他菌株, 其1次脱胶率可达33.37%。这与A₁菌株具有较高的木聚糖酶和果胶酶酶活性有关。在累计3次脱胶后, A₁菌株的脱胶速率变缓, 而木聚糖酶活性较低的C₁₁菌株脱胶速率有所上升。但3次脱胶后, A₁菌株脱胶减重率始终最高, 达到49.26%。杨丹等^[13]研究表明, 在最佳条件下筛选得到的脱胶菌对苎麻胶质的1次去除率为25.94%。与之相比, 笔者研究中的A₁菌株脱胶较为高效, 对凤眼莲生物脱胶具有极大的潜力。

2.4 菌株的鉴定

将A₁菌株进行革兰染色, 于显微镜下观察, 其染色结果为紫色, 显示为革兰阳性, 细菌为短杆状。

通过GenBank中的基因序列对比, A₁菌株与解淀粉芽孢杆菌MPA1034(Bacillus amyloliquefaciens strain MPA 1034)、解淀粉芽孢杆菌亚种植物乳杆菌FZB 42(Bacillus amyloliquefaciens subsp.Plantarum strain FZB 42)、杀线虫剂芽孢杆菌(Bacillus nematocida strain B-16) 等十几株菌株序列的相似性分别高达99%, 选取同源性较高的6株菌株构建系统发育树。从图 3可以看出, A₁菌株与Bacillus amyloliquefaciens subsp. Plantarum strain FZB42(登录号为NR 075005.1) 同源性最高。可初步判定A₁属于解淀粉芽孢杆菌属(Bacillus amyloliquefaciens)。报道显示, 解淀粉芽孢杆菌与枯草杆菌亲缘性极大, 可以通过分泌胞外酶或酯肽类物质有效抑制细菌及真菌, 促进丁草胺的降解^[23]。翟秋梅等^[24]从罗布麻表皮中筛选出一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis FM208849), 对罗布麻有良好的脱胶效果。于丽萍等^[25]从沤麻液中得到一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis HW201), 可在达到传统工艺沤麻效果的同时降低沤麻周期。吴皓琼等^[26]对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis HW201) 沤麻条件进行了优化, 证实该菌在沤麻过程中有脱胶能力。解淀粉芽孢杆菌与枯草杆菌亲缘关系较为接近, 因此解淀粉芽孢杆菌中极有可能携带类似枯草芽孢杆菌中脱胶酶的基因。李超等^[27]从富营养化水中分离得到一株解淀粉芽孢杆菌DC1, 具有溶藻能力, 可以通过分泌胞外物质使鱼腥藻长链聚集成团后断裂, 进而溶解藻细胞。这些研究间接表明解淀粉芽孢杆菌可以分泌出某种破坏植物细胞壁的物质, 这对于植物细胞壁中纤维素等可利用成分的释放具有重要意义。

3 结论

(1) 从凤眼莲生长的池塘底泥中分离得到一株高效的凤眼莲脱胶菌, 经16S rRNA鉴定，该菌株为解淀粉芽孢杆菌。

(2) 控制温度为35 ℃, 接种率为4%, pH值为7.0, 振荡速率为145 r·min^-1条件下, A₁菌株的最佳脱胶周期为72 h。

(3) A₁菌株为比较理想的凤眼莲脱胶菌, 其1次脱胶减重率可达33.37%, 连续3次累计脱胶的减重率可达49.26%。