随着人口老龄化以及多吃少动生活方式的盛行, 肥胖及其相关疾病, 如动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)、糖尿病、冠心病等的发病率逐年上升, 已成为危害人类健康的主要疾病。肥胖及其相关疾病被认为是系统性的慢性低度炎症^[1]。肥胖时肝和脂肪组织中巨噬细胞的浸润以及血浆炎症因子CRP、TNF-α、IL-6和脂肪因子leptin的显著增加是慢性低度炎症最显著的特征^[1-5]。除了上述经典的炎症和脂肪因子之外, chemerin在肥胖及其相关疾病中的作用日益引起人们关注, 已成为肥胖及其相关疾病的研究热点。

chemerin是新发现的脂肪因子, 亦被称为他扎罗汀诱导基因2和视黄酸受体反应因子2^[6], 在脂肪和肝组织中高表达。1997年首次在银屑病患者皮肤中发现, 鉴别为他扎罗汀诱导基因2(TIG2), 但直到2003年在人类炎症性液体中也检测到它时才命名为chemerin, 被认为是一种孤儿G蛋白偶联受体趋化因子样受体1(CMKLR1, 亦被称为ChemR23) 的配体^[7], 到2007年才认识到它是一个脂肪因子和炎症因子。已证实chemerin与炎症标志物如CRP、TNF-α、IL-6等显著相关^[8-9]。越来越多的研究证实, 血浆chemerin的表达和活性在糖脂代谢紊乱疾病, 如肥胖^[10-11]、代谢综合征^[11-12]、2型糖尿病^{[8, 13-14]}, 以及AS^[15-18]中显著增加, 且可能与疾病的发生、发展和严重程度密切相关。chemerin有可能成为治疗肥胖及其相关疾病的靶分子。值得一提的是, 近年研究发现chemerin可促进巨噬细胞的胆固醇蓄积和巨噬细胞向泡沫细胞的转化, 从而在AS的形成以及粥样斑块的大小中起重要作用^[17]。

有氧运动减轻肥胖、改善肥胖相关疾病如AS、糖尿病已成为共识。有氧运动改善肥胖及其相关疾病的作用机制与其减轻这些疾病的炎症状态有关^[19-20]。有氧运动改善AS大鼠的动脉硬化程度也与其抗炎作用有关, 如减轻单核/巨噬细胞在主动脉壁的附着和浸润、降低主动脉壁炎症因子的水平^[21], 但目前还没有关于有氧运动改善AS是否与炎症因子chemerin有关的研究报道。可以明确的是, 有氧运动能降低肥胖^[22-24]和2型糖尿病^[25]患者血清chemerin的水平, 且chemerin的降低与肥胖和糖尿病患者的血脂、血糖的改善有关。本文拟在AS模型大鼠中研究4周有氧运动对chemerin的影响及其与血脂和主动脉AS程度改善的相关性, 不仅有助于认识有氧运动改善AS的机制, 还能为AS的治疗提供新的靶分子。

6周龄雄性SD大鼠30只, 体重190~210 g, 购于北京维通利华实验技术有限公司(合格证号:SCXK(京)2012—0001)。在上海体育学院SPF级动物实验室喂养大鼠, 自由饮水饮食, 温度控制在20~24 ℃, 相对湿度为40%~55%, 白天光照12 h, 晚上关灯。

30只雄性SD大鼠被适应性喂养一周后, 随机分为2组:AS造模组(20只)和正常对照组(Con, 10只)。采用一次性腹腔注射维生素D3(60万IU/kg, 购于上海通用药业股份有限公司)联合8周高脂饲料喂养(含3%胆固醇, 0.5%胆酸钠, 0.2%丙基硫氧嘧啶, 5%白糖, 10%猪油和81.3%普通饲料)的方法制备AS模型大鼠; Con组大鼠腹腔一次性注射等量的生理盐水后, 喂以普通饲料。8周喂养后, Con组和AS造模组分别随机选择2只和4只, 眼眶取血检测血脂水平, 处死大鼠后剥离主动脉进行大体和病理学检查, 以明确AS模型大鼠是否制备成功。确认成功后, AS造模大鼠被随机分为AS组和EAS(运动+AS)组, 每组各8只。

EAS组大鼠先进行3 d的跑台适应性训练, 紧接着在跑台上进行为期4周的递增负荷中等强度有氧运动(表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 有氧运动方案 Table 1 Aerobic exercise protocol 周次 v/(m·min-1) t/min 1 15 30 2 15 60 3 20 60 4 20 90

表 1 有氧运动方案 Table 1 Aerobic exercise protocol

4周运动前后, 大鼠禁食12 h后眼眶静脉丛采血, 收集血清。最后一次跑台运动干预结束后36 h, 水合氯醛麻醉处死大鼠, 收集肝脏。罗氏血糖仪检测空腹血糖; 全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL)和高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL)的水平(试剂购自南京建成公司)。ELISA方法检测血清chemerin的水平(试剂盒购于美国Life Span Biosciences公司)。

大鼠麻醉后, 沿主动脉弓至肾主动脉分支处剥离全长动脉。生理盐水清洗后, 4%多聚甲醛固定, 油红O染色。剪取有斑块的动脉进行石蜡包埋、切片和HE染色。

用TRIzol试剂(购自美国Invitrogen公司)抽提大鼠肝总的RNA, 逆转录成cDNA(逆转录试剂盒购自美国Thermo公司), 进行real time PCR扩增(chemerin及内参GAPDH的引物序列见表 2, 上海生工生物工程公司合成, 扩增试剂盒购自美国Roche公司), 采用两步法45个循环, 95 ℃变性15 s、60 ℃退火延伸60 s进行扩增。

表 2(Table 2)

表 2 chemerin和GAPDH的引物序列 Table 2 Primes sequences of chemerin and GAPDH 基因 引物序列(5’-3’) chemerin forward: CGA GTG TCG GGA TTT AGT reverse: GGT AGG CAT CGT AGG TGA GAPDH forward: GCT GAG TAT GTC GTG GAG reverse: TCT TCT GAG TGG CAG TGA T

表 2 chemerin和GAPDH的引物序列 Table 2 Primes sequences of chemerin and GAPDH

取50 mg肝脏, 加入1 mL的含PMSF的RIPA裂解液(RIPA:PMSF=100:1, 购目上海碧云天公司), 机械匀浆后超声裂解组织, 4 ℃12 000 r/min离心30 min后取上清, 用BCA法检测蛋白浓度。30 μg的待测样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到PVDF膜上, 5%的脱脂奶粉4 ℃封闭过夜, 加入chemerin(英国abcom公司, 1:500稀释)和β-actin(美国CST公司, 1:1 000稀释)的一抗, 4 ℃孵育过夜, TBST洗3次后, 加入相应的二抗(美国santa cruz公司, 1:5 000稀释), 常温下孵育1 h, TBST洗3次后在显影仪(购自上海天能生物科技公司)上显影。

采用SPSS17.0统计学软件包进行数据处理, 结果采用平均数±标准差表示。体重和血糖、血脂采用重复测量的方差分析, 其余指标采用单因素方差分析, P＜0.05为显著性差异, P＜0.01为非常显著性差异。

AS模型大鼠出现了血脂异常, 包括血清TC、TG、LDL水平显著升高, 血清HDL水平显著降低(表 3)。如图 1(a)所示的主动脉大体标本, AS模型大鼠出现了红色的粥样斑块, 而正常对照大鼠无粥样斑块; 与正常对照大鼠相比, 显微镜下见AS模型大鼠斑块处的主动脉管壁增厚, 平滑肌细胞增生, 细胞排列紊乱[图 1(b)]。

表 3(Table 3)

表 3 动脉粥样硬化模型大鼠的血脂水平 Table 3 Serum lipids profile of the AS model rats mmol/L 组别 TC TG LDL HDL Con(n=8) 1.23±0.33 0.29±0.02 0.38±0.06 0.22±0.02 AS(n=16) 9.05±1.35** 0.57±0.10* 4.19±0.79** 0.13±0.04** 注:与Con组相比, *表示P＜0.05, **表示P＜0.01

表 3 动脉粥样硬化模型大鼠的血脂水平 Table 3 Serum lipids profile of the AS model rats

图 1(Figure 1)

图 1 动脉粥样硬化模型大鼠主动脉的大体(a)和镜下切片(b)改变 Figure 1 Gross and pathological changes of aortas in AS model rats 注:(a)为主动脉油红O染色; (b)为主动脉石蜡切片HE染色; 图 5同此

Con组大鼠的体重始终保持增长, AS和EAS组大鼠的体重负增长, 但EAS与AS组相比, 大鼠的体重无显著性变化(表 4)。与Con组相比, AS组的相对肾周脂肪量(肾周脂肪重量/体重的比值)无显著性差异; 但EAS组大鼠的相对肾周脂肪量比Con组和AS组显著降低(图 2)。

表 4(Table 4)

表 4 4周有氧运动干预期间大鼠的体重变化 Table 4 Difference of body weight between AS and EAS rats during 4 weeks exercise g 周次 Con AS EAS n=8 n=8 n=8 0 468.33±23.00 294.00±31.89** 331.67±11.24** 1 478.33±28.54 291.00±34.19** 314.67±11.59** 2 497.67±29.16 283.50±34.63** 303.67±9.60** 3 510.33±29.84 278.00±33.78** 288.00±8.89** 4 503.67±28.45 272.25±29.78** 270.67±5.51** 注:与Con组相比, **表示P＜0.01;与AS组相比, ##表示P＜0.01;图 2同此

表 4 4周有氧运动干预期间大鼠的体重变化 Table 4 Difference of body weight between AS and EAS rats during 4 weeks exercise

图 2(Figure 2)

图 2 有氧运动降低动脉粥样硬化大鼠相对肾周脂肪的质量 Figure 2 Aerobic exercise-induced decreases of perirenal adipose/body weight ratio in AS rats

与Con组相比, AS造模大鼠(AS组和有氧运动干预前的EAS组)的空腹血糖均无显著性改变, 在正常范围之内(图 3)。有氧运动干预后的EAS组大鼠的空腹血糖与AS组无差别, 且仍然在正常范围内。

图 3(Figure 3)

图 3 有氧运动不改变动脉粥样硬化大鼠的空腹血糖 Figure 3 No change of fasting plasma glucose (FPG) between AS and EAS rats during 4 weeks exercise

4周有氧运动干预后, EAS组大鼠的血清TC、TG、LDL水平比AS组均显著降低, 但仍高于Con组大鼠; 而EAS组大鼠的血清HDL水平无显著变化(图 4)。

图 4(Figure 4)

图 4 有氧运动改善动脉粥样硬化大鼠的血脂水平 Figure 4 Aerobic exercise-induced improvements of serum lipids in AS rats 注:与Con组相比, *表示P＜0.05, **表示P＜0.01;与AS相比, #表示P＜0.05, ##表示P＜0.01;图 6同此

与AS组相比, EAS组大鼠主动脉的红色粥样硬化斑点较显著减少[图 5(a)], 且斑块处主动脉中膜的平滑肌细胞增生和排列紊乱显著改善[图 5(b)]。

图 5(Figure 5)

图 5 有氧运动减轻动脉粥样硬化大鼠主动脉斑块的严重程度 Figure 5 Aerobic exercise-induced reduction of atherosclerosis severity of aorta in AS rats

与Con组对比, AS组大鼠血清chemerin水平显著增加。4周有氧运动干预后, EAS组大鼠的血清chemerin水平显著降低, 且降低至Con组水平(图 6)。

图 6(Figure 6)

图 6 有氧运动降低动脉粥样硬化大鼠的血清chemerin水平 Figure 6 Aerobic exercise-induced retrieve of serum chemerin in AS rats

与Con大鼠相比, AS组大鼠肝chemerin的mRNA[图 7(a)]和蛋白[图 7(b)]表达水平显著增加, 而EAS组大鼠肝chemerin的mRNA和蛋白表达水平显著降低。

图 7(Figure 7)

图 7 有氧运动降低动脉粥样硬化大鼠肝chemerin的mRNA和蛋白表达水平 Figure 7 Aerobic exercise-induced decreases of mRNA (A) and protein (B) levels of chemerin in the livers of AS rats 注:(a)肝脏chemerin的mRNA表达水平; (b) chemerin的蛋白表达水平。(b)上部分图为Western blot的蛋白条带; (b)下部分是将肝的各样本chemerin的蛋白水平用Image J软件进行分析, 以β-actin进行标准化; 与Con组相比, *表示P＜0.05, **表示P＜0.01;与AS组相比, #表示P＜0.05

作为一个趋化因子, chemerin促进多种表达其受体ChemR23的免疫细胞(巨噬细胞、未成熟的树突状细胞等)的募集和迁移^[27], 增强巨噬细胞与血管内皮的粘附, 以及巨噬细胞在细胞间质的迁移^[28], 从而参与多种组织包括脂肪、肝、骨骼肌、胰岛和血管等的炎细胞浸润、黏附和迁移。除了促炎作用, chemerin在脂肪细胞的分化、脂肪分解和维持血糖稳态中也发挥重要作用^{[15, 29]}。ChemR23(chemerin的受体)基因敲除的小鼠较少发生严重的感染性疾病^[29]的同时, 脂肪的生成和糖耐量出现问题^[30]、体重和肌肉重量减轻^[31], 这间接证明chemerin在调控炎症反应和糖脂代谢中起桥梁作用。chemerin能抑制脂肪的分解和肌肉等组织的糖摄取, 导致胰岛素抵抗, 在血糖和血脂的紊乱中发挥重要作用, 且该作用可能与chemerin使调控糖、脂代谢的重要基因(如葡萄糖转运子4(GLUT4)、leptin和脂联素)的表达出现障碍有关^[32]。

血清chemerin水平在肥胖及相关疾病如代谢综合征^[11-12]、2型糖尿病^{[8, 13-14]}、AS^[15-18]和冠心病^[33]患者中显著增加, 并与糖脂代谢的紊乱密切相关。肥胖患者减重手术后, 伴随着显著的体重降低和糖脂代谢的改善, 血浆chemerin水平也显著降低^[34], 这证实了chemerin在肥胖患者糖脂代谢紊乱中的作用。chemerin在AS中的作用也得到较多文献的支持。如人体实验证实, 在AS患者的血管外周脂肪、血管平滑肌细胞和泡沫细胞中检测到chemerin, 且chemerin水平与AS的严重程度显著相关^[35]; 冠状动脉粥样硬化心脏病(冠心病)患者的血清chemerin水平显著升高^[36], 冠心病患者心包外膜的脂肪组织、冠状动脉斑块的泡沫细胞的chemerin基因高表达^[37]。动物实验也证实, AS大鼠主动脉的chemerin基因表达水平显著增加^[17]。在细胞水平上, chemerin能明显增加人巨噬细胞对胆固醇的摄取^[38], 以及促进THP-1源性巨噬细胞的胆固醇蓄积和巨噬细胞向泡沫细胞的转化^[39]。上述人体和动物实验、在体和体外的研究均表明, 高表达的chemerin促进AS的炎症反应, 且与AS的严重程度有关。由于肝是血清chemerin的主要来源之一, 故本文除了检测血清chemerin水平, 还检测了肝chemerin的mRNA和蛋白表达水平, 证实了AS大鼠血清和肝的chemerin水平均显著升高, 且与上述报道的结果一致。

周期性、中小运动强度的有氧运动有益于防治肥胖及其相关疾病, 该作用至少部分与有氧运动的抗炎作用有关^[40-42]。伴随着有氧运动改善糖脂代谢、提高胰岛素敏感性的同时, 肥胖和糖尿病患者的炎症因子chemerin水平显著降低。如4个月^{[22, 43]}、甚至一次的有氧运动对肥胖患者^[24]、1 a规律的中等强度行走对2型糖尿病患者^[44]都有显著降低血浆chemerin水平的作用。本研究发现, AS大鼠的血脂异常(血清TC、TG和LDL升高, HDL降低都是AS的主要危险因素)和主动脉出现粥样硬化斑块的同时, 血清和肝chemerin水平增加, 而4周有氧运动改善AS大鼠的血脂、减少肾周脂肪和减轻AS程度的同时, 血清和肝chemerin水平也降低, 提示血清和肝chemerin的降低可能与有氧运动改善血脂、减少肾周脂肪和减轻主动脉AS程度有关。本文加深了对chemerin的认识, 即在文献证实chemerin与有氧运动改善肥胖和2型糖尿病患者糖脂代谢有关的基础上, 发现chemerin也与有氧运动改善AS的血脂、体脂和主动脉AS程度有关。

AS大鼠的血清chemerin、肝chemerin的mRNA和蛋白水平均显著升高。4周有氧运动改善AS大鼠的血脂、减少肾周脂肪量和减轻AS程度, 这可能与其降低血清和肝的chemerin水平有关。