乳酸菌中嗜热链球菌是酸奶及奶酪生产过程中非常重要的发酵菌株，优点是可以赋予发酵产品特殊质地以及风味等。其菌株的活力对发酵剂特性有直接影响，因而会影响终产品的质量。目前我国大多是以国外进口的直投式发酵剂作为生产酸奶的菌株，虽然国内也有少量自主研发产品出现，但大多缺点明显，菌株活力低、发酵性能差等，与国外产品相去甚远。所以，自主研发高活力、性能稳定的，活性高的发酵剂菌株势在必行。

Badel^[1]等人研究菌株产生胞外多糖(EPS)增加发酵乳的粘稠度，Duboc^[2]等人证明了胞外多糖多聚物作为增稠剂、胶凝剂改善酸奶的品质，孟利^[3]等人证明其有改善肠道微环境、抗癌、增强人体免疫力等生理作用，提高了产品的营养保健功能。通过对分离自新疆地区传统酸奶中的20株菌的生长、产酸的能力和产胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)的能力以及尿素分解能力等指标的测定，得到一株有较高发酵性能的嗜热链球菌菌株，命名为QLMCC19。

1 实验材料和方法 1.1 菌株

实验所用嗜热链球菌株除S.thermophilus YL外都来自于新疆传统的发酵乳。S.thermophilus YL和L.bulgaricus JB均是从市场上销售的伊利及佳宝酸奶中分离得到的。

1.2 培养基和实验仪器

M17培养基；CDM培养基；尿素琼脂平板。pH计(METTLER TOLEDO，FE20)，分光光度计(Eppendorf BioPhotometer，RS232-)；真空浓缩仪(Eppendorf Concentrator 5301，AG 22331 Hamburg)；数字式粘度计(上海精天电子仪器，DV-1)。

1.3 实验方法 1.3.1 Lysozyme/phenol法从纯培养物中提取总DNA以及发酵乳的制备方法

涉及到的两种发酵乳：检测酸度的发酵乳以及感官品评的发酵乳。检测酸度是用发酵乳为12%(W/V)的脱脂奶粉, 110 ℃下灭菌15 min，放凉，然后按2%将嗜热链球菌接入其中，42 ℃下培养3 h，检测该发酵乳的总酸度。感官品评的发酵乳用的纯牛奶以巴氏灭菌法处理，再加入6%的白砂糖，嗜热菌株和L.bulgaricus JB以1:2比例接入到纯牛奶中，42 ℃下培养6 h，经过室温后熟和低温冷藏后，由实验室的人员进行品尝并作出评价。

1.3.2 酸奶基本属性测定

分别对发酵乳的酸度测定以及发酵乳活菌数测定、菌株利用半乳糖能力分析、菌株脲酶活性检测、发酵乳脱水收缩性进行测定。

1.3.3 菌株产胞外多糖(EPS)的能力分析

将嗜热链球菌接种于LM17液体培养基上，在42 ℃下静置培养24 h。在10 000×g, 1 min离心，收取菌体，悬浮于TPM buffer，调整浓度为5×10⁸ 个/mL。将菌体与刚果红染料按1:1体积混合均匀。25 ℃下静置避光30 min，16 000×g，离心5 min，上清液以及染色液以TPM buffer作空白对照，在490 nm下检测刚果红染料吸收值，每种重复3次。

2 结果与讨论 2.1 嗜热链球菌菌株的筛选

首先，选取正向引S139F 5'-TGGAATTCAGCGCGAGAGTCTACG-3'和反向引物S1252R5'-TAGTCGACTGACTAATACCGATACG-3', 对乳酸菌进行嗜热链球菌快速鉴定筛选^[4]。从实验室的乳酸菌库中得到20株菌中7株菌的PCR扩增条带为1113bp(图 1)

由图 1得，该条带与对照菌株S.thermophilus YL目的条带一致，是嗜热链球菌，将其命名为QLMCC01-QLMCC20。

2.2 嗜热链球菌菌株的生长以及产酸能力的比较

筛选酸奶发酵剂的非常重要指标之一是该菌株的产酸能力。嗜热链球菌发酵的末端产物主要是乳酸，发酵方式同型乳酸发酵。菌株把原料奶中的乳糖转变成乳酸，令pH值降低进而酸化，使酪蛋白凝集沉淀，即凝乳。酸奶的质量与发酵剂的产酸能力是直接相关的，用生长速度快及产酸能力强的发酵剂能缩短时间并节约成本。酸度可分为总酸度和有效酸度。总酸度是指所有酸性物质的总量，其中包括已解离的酸浓度；有效酸度即样品中游离状态的氢离子浓度，以pH计测定。对筛选到的20株菌的生长及产酸能力测定，结果如图 2、图 3所示。

由图 2得出，不同菌株的生长能力差别很大，QLMCC11和QLMCC19在培养24 h后，OD₆₀₀值接近到3.0，而QLMCC06、QLMCC14的生长能力较弱，培养24 h后OD₆₀₀值不到1.0。因此，不同的酸奶中菌株的生长能力差别较大。

由图 3得出, 生物量高的菌株产酸能力强，如QLMCC07、QLMCC19。也有菌株，比如QLMCC03，产酸能力最强，但生物量却不高。

随后，选取4份pH小于5.0的发酵乳，然后进行总酸度滴定，结果如表 1所示。

酸奶酸度的测定方法是以氢氧化钠标准溶液滴定，使用的浓度为0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数乘以10，得到酸度°T ^[5]。

根据酸奶统一国家标准(GB2746—1999)，发酵乳的酸度需要大于70°T，原味酸奶的优良口感酸度一般在85~95 °T^[6]。由表 1可得，选取的4株嗜热链球菌菌株都已达到国家标准，其中菌株QLMCC07和菌株QLMCC19的酸度最适合，口感良好。

2.3 嗜热链球菌的菌株半乳糖利用能力研究

嗜热链球菌可利用的糖类有乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖以及半乳糖，其中半乳糖、果糖只能被个别菌株利用。大部分的菌株不能通过Leloir途径利用半乳糖，被LacS泵出细胞外^[7]。半乳糖经嗜热链球菌泵出胞外后能缓解“乳糖不耐症”，但在制备过程中会造成碳源浪费。所以需要筛选能够利用半乳糖的菌株，以此来提高碳源利用率。通过分析20株菌的半乳糖利用能力得出，菌株QLMCC02、QLMCC14、QLMCC18株菌具有能力利用半乳糖，占总菌株的15%。这个比例高于“少数菌株有半乳糖利用能力”的规律，如图 4所示。

由图 4可得，QLMCC14和QLMCC18在半乳糖为唯一碳源的CDM中OD_{600 nm}达到0.613±0.03和0.652±0.04。鉴于这两株菌在培养基中的生物量比较高，认为菌株的生长能力与该菌株利用半乳糖的能力有关，具有利用半乳糖能力的菌株可有效利用碳源，具有最大的生长能力。

2.4 嗜热链球菌的脲酶活性分析

嗜热链球菌是发酵剂中唯一具有脲酶活性的菌株，在其发酵过程中能将尿素转变成氨，不仅提供了额外的氮源，还产生风味物质以及有助于菌株抵抗酸胁迫^[8]。分析20株嗜热菌株的脲酶活性，发现菌株都可以分解尿素，但是不同菌株脲酶活性是不同的(表 2)。

我们以没有脲酶活性的菌株L.ATCC11842为阴性对照(表 2)，该菌株不能分解尿素，在嗅甲酚紫平板上不会改变颜色pH(6.0)。嗜热链球菌有脲酶活性，能分解尿素使pH升高，使溴百里酚蓝发生反应，变成蓝绿色。表 2B、C、D依次是脲酶的活性由强减弱的颜色。当前，脲酶活性未被列入筛选发酵剂的指标，但脲酶活性在菌株抵抗酸胁迫压力这方面意义很重要。

2.5 嗜热链球菌产胞外多糖(EPS)的能力分析

嗜热链球菌是乳品发酵剂常用的菌株之一^[9]。通过相关文献数据可知，嗜热链球菌的多糖产量甚至可以大于50 mg /L^[10]。发酵乳粘度的测定是在4 ℃下取适量酸奶放入烧杯，用DV-1的三号转子以60 r/min、扭矩10%~100%进行测定，时间为30 s。发酵过程中产生EPS能够令发酵乳有“可拉丝”的现象，质地粘稠，是酸奶粘稠的主要原因。除此之外，EPS也有消除发酵乳脱水收缩、维持产品结构等优点^[11]。所以，EPS产量高是优良的乳品发酵菌株的必要条件。较低温度下，菌体生长速度也较慢，因此细胞壁的合成速度也减慢，从而使较多的磷酸异戊二烯被菌体用于合成EPS^[12]。以刚果红结合EPS法分析20株嗜热链球菌的产EPS的能力。刚果红的特征值吸收峰在490 nm处，记为A。与EPS结合高速离心后，刚果红和EPS产生螯合物沉淀下来，刚果红浓度降低，然后检测490 nm处吸收值，标记为B。用A与B的差值来显示嗜热链球菌产EPS的能力，AB差值的大小证明该菌株EPS产量的多少。结果如图 5所示。

由图 5得，不同菌株EPS产生能力是不一样的。在这20株菌株中，QLMCC16和QLMCC18产EPS的能力较强，但QMCC07和QLMCC20产EPS的能力相对较弱，且明显比其他嗜热链球菌低。

2.6 其他发酵乳指标检测分析以及感官品评

综合评价以上菌株的生长、产酸、胞外多糖产量等，选出四株嗜热菌株：QLMCC02、QLMCC03、QLMCC18和QLMCC19。以从市售伊利酸奶分离出的S.thermophilus YL作为阳性对照进行实验，对该发酵乳进行活菌数的检测和感官品评等评价。选择以凝乳时间、酸度、脱水收缩等特征来品评菌株的发酵能力。结果如表 3所示。

脱水性检测的方法是取20 g样品，4 ℃低速离心(1 000 r/min, 10 min), 后取上清液，再检测重量。

脱水收缩性公式：脱水收缩性=上清液重量(g)/样品重量(g)×100%。

菌株发酵能力较强，能将牛奶凝固时间控制在5 h 10 min内。由表 2得，QLMCC19凝乳时间最少，只有4 h 30 min。其发酵酸奶的酸度都维持在85~95°T之间，酸度适宜。此菌株脱水收缩性低持水性较好，乳清析出少。其中，QLMCC19和S.thermophilus YL持水性最好，有光泽，颗粒度好，有堆积感和拉丝感，入口饱满、清爽、有粘连感、硬度适中、空口留香，而QLMCC03和QLMCC02持水性较差，有涩口感，颗粒度差，堆积感差等。此外，酸奶中嗜热链球菌活菌数都达到10⁸，符合国家制定标准^[13]。综上，选择QLMCC19为最优发酵菌株，其冻干后菌量为1 011 cfu/g，发酵出的酸奶各项指标都达到市售酸奶的水平，同时缩短发酵时间，提高效率，节约成本。

将筛选出的菌株QLMCC19接到甘油管中，放到4 ℃冷藏保存。

3 结论与展望

以性能优良的嗜热链球菌作为目的菌株，以酸奶发酵剂的几个重要指标对菌株比较和筛选。选出的菌株QLMCC19在发酵过程中持水性较好，EPS产量较高，用这株菌株作为发酵剂可以从根本上解决酸奶硬度不够、黏糊状的现象，排除添加明胶等添加剂来维持酸奶硬度的影响^[14]。选择冷冻干燥保护剂甘油来保存菌株QLMCC19。与液体发酵剂相比，选出的QLMCC19菌株可以直接投入到发酵罐中生产酸奶，贮藏在普通冰箱中即可，运输成本和贮藏成本都低，使用过程中的方便性、低成本性和品质稳定性突出。实验中还发现菌株QLMCC19可利用半乳糖，产酸能力强、发酵时间短，是一株性能优良的发酵剂潜力菌株，该菌株的发现为研究和开发乳酸菌直投式发酵剂打下了基础。