2016, Vol. 6
2. 中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)实验血液学国家重点实验室
近年来，基因编辑技术取得了突飞猛进的发展，从早期的锌指核酸酶(ZFN)和转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)阶段到最近开发出来的基于规律性间隔的短回文序列重复簇(CRISPR)/Cas9系统的基因组编辑技术。另外，今年我国科学家韩春雨发明了应用格氏嗜盐碱杆菌的NgAgo基因编辑技术。这些技术均成功实现了RNA和DNA引导的基因组编辑，允许轻松和可控的进行基因编辑，为进行基因功能研究提供了强有力的研究工具。其中，CRISPR/Cas9系统和NgAgo基因组编辑技术通过功能基因组筛选识别新型药物靶标，并采用基因敲除制备疾病实验动物模型，以及治疗基因靶标和检验药物疗效进行验证，因此对基因和细胞替代疗法及新药研发的影响是巨大的。目前，基因编辑技术已经广泛应用于从修改植物基因到改变蝴蝶翅膀的图案，再到制备小鼠和大鼠等动物疾病模型；从培育抗虫害的生菜到降低菌类植物菌株的致病性，再到修改人类细胞。科学家们认为通过基因编辑技术将有可能治愈困扰人类许久的肌肉萎缩症、囊性纤维化和镰状细胞性贫血等多种单基因遗传性疾病。在基因编辑技术高速发展的基础上，2015年4月我国英文版学术期刊《蛋白质与细胞》(Protein and Cell)发表了中山大学黄军就研究团队关于利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对人类胚胎中地中海贫血症致病基因修饰的研究成果[1]。2016年广州医科大学附属第三医院范勇团队，又在国际学术期刊《辅助生殖与遗传学》(Journal of Assisted Reproduction and Genetics)上刊发了人类胚胎基因编辑的最新研究成果，他们对废弃的人类3PN受精卵进行编辑，让4个受精卵成功免疫HIV[2]。这两篇论文发表后舆论哗然，着实引起了广泛的对伦理问题的大讨论。本文将从基因编辑技术的原理、应用前景到人类胚胎基因编辑的科学性、以及相关伦理问题进行讨论，最后对监管机构制定政策提出意见和建议，希望能够保证科学研究不与社会伦理相违背。
一、 基因编辑技术领域的现状和发展趋势基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成兴趣基因的定点敲除、突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删失等。基因编辑技术依赖于强大而稳定的“关闭”、“恢复”和“切换”三大技能，可在基因组水平上进行精确的基因修饰。简要地说，便是在基因组特定位置通过特定某种方式引入双链DNA的断裂，通过对新序列靶定点改变基因组或对其进行修饰。
1. 基因编辑技术研究现状在科学技术领域，基因编辑技术可以快速构建模式细胞或者模式动物，节约大量科研时间和经费；在农业领域，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的要求，如改良水稻等粮食作物，增加产量[3]，提高抗病抗虫害等作用；改造酵母基因，提高酿酒的产量和质量[4]。医学研究中基因编辑技术可以更加准确地构建疾病模型，深入地了解疾病发病机理和探究致病基因的生物学功能，进而通过改造人的基因，达到基因治疗的目的等。例如，应用TALEN和CRISPR/Cas介导的基因编辑技术分析糖尿病及其它先天性疾病发病机理[5]；应用ZFNs和TALENs基因编辑技术编辑IL2RG基因突变制备免疫缺陷综合症狨猴疾病模型[6]。这些工作为免疫性疾病临床前和医学转化研究提供了重要的疾病模型，为基因治疗提供了切实可行的基础。因此，基因组编辑技术在农业、畜牧业和生物医学等诸多领域具有极其广泛的发展前景和应用价值。
基因编辑技术本质上均是利用非同源末端链接途径修复和同源重组修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9和NgAgo是目前主要的几种基因编辑技术。这三种编辑工具的共同点是：含有靶点DNA序的识别区域及DNA剪切功能区域。其中，ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA，而TALEN的DNA识别区域是重复可变双残基的重复，DNA剪切区域都是一种名为Fokl的核酸内切酶结构域。CRISPR的DNA识别区域是crRNA或向导RNA，Cas9蛋白负责DNA的剪切。当DNA结合域识别靶点DNA序列后，核酸内切酶或Cas9蛋白将DNA剪切，靶DNA双链断裂，再启动DNA损伤修复机制，实现目标基因定量敲除和插入等操作过程，修复基因突变引起的多种表征。值得注意的是，在2016年5月中国科学家韩春雨教授的研究团队利用格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute实现了DNA引导的基因组编辑，并发现NgAgo作为一种DNA介导的核酸内切酶，适合在人体细胞中进行基因组编辑[7]。与CRISPR/Cas9系统通过RNA寻找替换序列相比，NgAgo系统的优势是直接通过DNA作为介导寻找替换目标。
2. 几种基因编辑技术的优缺点ZFN技术：ZFN技术的基因打靶效率能够达到30%左右，已经可以做到针对某些特定的序列来设计ZFN实现靶基因的修饰，但也有其发展的局限性。ZFN的识别结构域中存在前后序列依赖效应，使得ZFN设计和筛选效率大大降低，所以目前尚无法实现对任意一段序列均可设计出满足要求的ZFN，也无法实现在每一个基因或其他功能性染色体区段都能够顺利找到适合的ZFN作用位点。所以，在ZFN的筛选和设计方面还存在较大技术困难。另外，由于ZFN的脱靶切割会导致细胞毒性，使得其在基因治疗领域的应用出现了一定的局限性。
TALEN技术：相比ZFN技术，TALEN使用了TALE分子代替ZFN作为人工核酸酶的识别结构域，极好地解决了ZFN对于DNA序列识别特异性低的问题。TALE蛋白与DNA碱基是一一对应的，并且对碱基的识别只由两个氨基酸残基决定，这相对于ZFN的设计要简单得多。但是在构建过程中，TALE分子的模块组装和筛选过程比较繁杂，需要大量的测序工作，对于普通实验室的可操作性较低，而商业化公司构建费用昂贵。此外，相对于ZFN技术，TALEN技术大大降低了脱靶率，但是还是会有脱靶情况的发生，脱靶后不仅目标基因编辑失败，更大的危害在于人工核酸酶对基因组中具有与靶序列相似的基因进行编辑，进而可能产生不可预估的严重后果。
CRISPR/Cas技术：相较于ZFN和TALEN两种人工核酸酶技术，CRISPR/Cas9系统是一个天然存在的原核生物RNA干扰系统，由crRNA、tracrRNA以及Cas9蛋白组成，其介导的基因组编辑是由crRNA指导的，对靶序列的识别是RNA与DNA的碱基配对过程，相比蛋白质对DNA序列的识别要精确很多，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性。而且CRISPR/Cas9的构建仅仅需要设计与靶序列互补的RNA即可，相对于TALEN更为高效、特异、操作简单易行且更为廉价。特别值得一提的是，CRISPR/Cas9可通过添加多个crRNA而实现多重编辑。但是，CRISPR/Cas9系统也存在着一些不足。首先，Cas9蛋白对于目标序列的切割不仅仅依靠crRNA序列的匹配，在目标序列附近必须存在一些小的前间区序列邻近基序(PAM)，如果目标序列周围不存在PAM或者无法严格配对，则Cas9蛋白不能对任意序列进行切割[8]。其次，由于crRNA序列比ZFN或TALEN所靶向的大部分序列更短，因此脱靶效应的几率会更高。最后，和ZFN及TALEN技术一样，CRISPR/Cas9也面临着如何控制双链断裂之后的非同源末端连接修复可能随机产生细胞毒性的问题。
NgAgo技术： NgAgo基因编辑技术的核心是格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute实现了DNA引导的基因组编辑。 Argonautes在基因表达抑制及抵御外源核酸中起关键作用，但是，Argonautes在许多方面不同于Cas9。比如，Cas9只存在于原核生物中，而Argonautes在进化过程中保守，存在于几乎所有生物体中，尽管大多数的Argonautes结合单链(ss)RNAs，在RNA沉默中起重要作用，一些Argonautes却可以结合ssDNAs并切割靶DNA。此外，Argonaute结合不要求特异的向导RNA二级结构，且Argonaute不要求靶序列上存在特异的序列[7]。但是NgAgo技术也是有缺点的，一方面，NgAgo只能切割具有负超螺旋构想的DNA，这就使得在分裂生长不活跃的细胞中的NgAgo编辑效率低下；另一方面，NgAgo的向导DNA导入细胞后可能会被整合到基因组上，这就造成了在人类细胞中导入外源DNA的风险。
二、 基因编辑技术的应用前景 1. 通过基因编辑技术进行基因功能研究CRISPR/Cas9系统的发展掀起了一场新的基因组工程研究革命，起初是CRISPR/Cas9系统被应用于蛋白编码基因的功能研究。Nakagawa Y 等的研究已经表明了应用CRISPR/Cas9 DNA编辑系统可以更加高效地产生单核苷酸替代小鼠或者条件性基因敲除小鼠[9]。Li W等利用CRISPR/Cas技术诱导大鼠的Tetl/Tet2/Tet3三个基因同时敲除．实现了效率高达100％的双等位基纯合突变的单基因敲除以及接近60％高效率的三基因同时敲除大鼠，并且证明CRISPR/Cas系统引入的基因修饰可以通过生殖细胞传递到下一代[10]。他们的研究在通过同一个模型动物研究多个基因的协同作用，或者不同基因具有功能代偿作用的情况下，使研究基因功能变得更加简单有效。
最近有大量基于CRISPR/Cas9的基因研究工具被广泛应用于非编码转录调节元件功能研究的报道，Canver MC等构建了一个CRISPR/Cas9介导的RNA文库用于制备任何小鼠增强子的原位饱和的基因突变，他们的研究验证了红细胞增强子可以作为BCL11A胎儿血红蛋白再诱导目标[11]。Korkmaz G等应用CRISPR/Cas9介导基因编辑技术鉴定了介导p53和ERα基因调节的几个功能性的增强子元件并对它们的功能进行了描述[12]。他们的结果表明通过应用CRISPR/Cas9系统基因编辑技术可以精确描绘增强子元件的功能结构域，在非编码基因功能研究方面具有重要的应用前景。
2. 通过基因编辑技术对患者进行治疗干预Rodolphe Barangou等首次证明了细菌可以利用 CRISPR 序列抵御外来噬菌体入侵，细菌Cas 位点编码的多个核酸酶和解旋酶可以把入侵的噬菌体DNA 切割，然后整合到CRISPR 的重复序列中，形成记忆。当下次再遇到相同噬菌体入侵时，细菌转录出RNA，Cas 蛋白复合物利用这些与入侵噬菌体DNA 同源的RNA，切割外源的DNA，从而达到识别并对抗噬菌体感染的目的。Cong L等发表了基于CRISPR/Cas9 技术在人类与小鼠细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的RNA 将Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变[8]。Mali P等的研究发现利用改造的CRISPR/Cas9 系统可以在人类不同的细胞系的靶位点形成单链或双链切口，然后激活细胞的DNA 修复机制，高效地介导定点突变与外源基因的定点插入[13]。Hu W等利用基因组编辑技术，首次成功地把艾滋病病毒从培养的人类细胞系中清除[14]，Kaminski R等也使用RNA-介导的CRISPR/Cas9 DNA 编辑系统精确的去除了HIV-1感染的人CD4+ T中的全部HIV-1基因组，且没有对T细胞的活率、细胞周期和细胞凋亡等生物学活性产生明显影响[15]。他们的结果表明CRISPR/Cas9基因编辑技术可能成为艾滋病患者治疗应用的一种选择,向治愈艾滋病迈出了重要一步。
三、 人类胚胎基因编辑技术的应用研究近年来，针对动物胚胎的基因编辑技术已经日趋成熟，前面已经提到的多种基因敲除动物模型，就是进行胚胎基因编辑的结果。单基因遗传病是指受一对等位基因控制的遗传病，目前研究已经表明，人类共有6600多种单基因遗传病，并且每年在以10—50种的速度递增，单基因遗传病已经对人类健康构成了较大的威胁。较常见的有红绿色盲、血友病、白化病等。据报道，目前大约有6%的婴儿有出生缺陷。因此，基因编辑技术对单基因遗传病的治疗作用可能将会使非常多的有出生缺陷的人受益。鉴于基因编辑技术已经在动物胚胎基因编辑中取得的成果，科学家们开始试图通过人胚胎基因编辑技术修饰基因缺陷达到治疗单基因遗传病的目的。2015年4月我国英文学术期刊Protein and Cell发表了中山大学黄军就副教授关于利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对人类胚胎中地中海贫血症致病基因修饰的研究成果[1]。紧接着广州医科大学附属第三医院博士范勇团队，又在国际期刊Journal of Assisted Reproduction and Genetics上刊发了人类胚胎基因编辑的最新成果，他们对废弃的人类3PN受精卵进行编辑，让4个受精卵成功免疫HIV[2]。这两篇论文发表后舆论哗然，引起了广泛的伦理和道德范畴的大讨论。
首先，黄军就和范勇所选用的是医院丢弃的问题胚胎(3PN胚胎)，而这些胚胎在世界各地的实验室都已经被广泛使用了数十年，由于它们不会成功孕育出婴儿，因此两项研究本身不存在伦理问题。他们的实验结果表明，从基因编辑到基因疗法技术，中间有明显的障碍，在进行任何临床应用之前，仍有许多问题要研究清楚。他们也提倡在很多问题没有研究清楚或者对伦理的讨论没有达成共识之前禁止对正常的可生育的胚胎进行任何的基因编辑。2015年，由中国科学院、美国国家科学院、美国国家医学院和英国皇家学会联合组织召集的“人类基因组编辑国际峰会”(International Summit on Human Gene Editing)在华盛顿拉开帷幕。专家们认为，不应完全禁止人类基因编辑技术的应用，但在证明这项技术安全可靠前，不能进行胚胎的基因编辑。
四、 基因编辑技术研究和应用涉及的伦理争议人类胚胎基因编辑研究牵动了科学家以及伦理学家的神经，引起了广泛的讨论和激烈的争议。一方面，基因编辑技术的巨大潜力确实极具诱惑，支持基因编辑技术尽快广泛应用的科学家们给我们描绘了一幅“无疾病、无饥饿、无污染和人人长寿的美好新世界”的美妙画面。但另一方面，这项技术在细胞内会有极少数的误切割，会带来潜在的风险，可能造成新的基因突变，使得未知的或癌症等慢性疾病的发病率增加，这些同样已经引发了科学家和伦理学家的严重关切。
目前有许多国家通过法律或者行业规范禁止生殖细胞基因修饰，明确禁止对人类胚胎的基因编辑，但也有很多国家对胚胎进行基因编辑没有立法或者态度暧昧。美国虽然没有通过有关人类生殖细胞或者人类胚胎基因编辑研究的相关法律，但是美国国立卫生研究院(NIH)明确表示禁止对人类生殖细胞和人类胚胎进行任何形式的基因编辑研究。相比而言，欧洲国家在对人类生殖细胞或人类胚胎基因编辑研究的规范性方面走在了世界的前列，1997年发表的欧洲人权和生物医学理事会公约禁止对人类生殖细胞和人类胚胎进行任何程度的基因组编辑和基因修饰。公约认为人类基因组是人类家庭所有成员的基础，是他们固有尊严和多元化的基础，在象征意义上基因组是人类共同的遗产。科学家们担心人类基因编辑可能会对人类的尊严、人类的胚胎的道德状态、人的本性、人类的进化产生负面影响。
如果没有严格的立法作为保障，非医疗目的的基因编辑技术也会很快乘乱而入成为人类胚胎基因编辑应用的主要领域，在将来甚至可能会产生超人或者超级长寿的人类，并且可以向下一代依次传递。将来的父母甚至为了非医疗目的通过“设计婴儿”将自己的后代变成俊男靓女，人与人之间基因组的差异越来越小，严重影响了人类的生物多样性，再考虑到基因编辑技术可能产生的脱靶或者别的基因编辑失误，再比如由于某些基因的修饰引起基因组的不稳定增加了慢性疾病的发病率，这些对人类的繁衍和生活方式等等都将会产生非常大的危害。
此外，基因编辑技术对人类生殖细胞或者人类胚胎的修饰应用产生了重要伦理问题。人类追求后代健康、美丽、聪明，这些目标可能需要对人类生殖细胞或者人类胚胎基因进行多次或多个基因的编辑修饰，就有可能制造出事实上的所谓的“无父母婴儿”。这就给婴儿和父亲或者母亲伦理关系认定带来很大的质疑。2015年底，中美英等多国科学家和伦理学家在华盛顿举办“人类基因编辑国际峰会”。此次会议为我们给出了是否应该开展人类生殖细胞或者人类胚胎基因编辑技术研究或应用的答案，会后声明划出的红线是，禁止出于生殖目的而使用基因编辑技术改变人类胚胎或生殖细胞。这意味着，用“基因剪刀”帮助自己治病可以，但不能用它来制造完美的下一代。
截至目前，中国对在基因编辑技术的应用所涉及的一些伦理问题进行了研究和讨论，但是法律和规范等监管措施方面依然存在大量空白。我们建议对人类生殖细胞或人类胚胎的基因编辑研究应该是相关的监管规范先行，在相关的法律和规范的监管下再进行相关的研究。在基因编辑技术还不是很稳定，且对基因编辑技术产生的动物模型个体还没有进行长时间的追踪的情况下，我们不能轻言进行人类胚胎的基因编辑。相关的行业协会、各级监管部门应该高度关注基因编辑技术的发展态势，切实履行责任，尽快组织相关专家进行广泛深入的调研、分析和论证，对基因编辑技术的研究范围、应用范围做出规范性的指导。对允许应用的领域研究制定伦理规范、技术标准、准入门槛，未经备案不得擅自开展人类胚胎基因编辑研究，对不允许研究不允许应用的领域划定政策的或者法律的红线，使得我国的基因编辑技术研究和应用做到有章可循、有法可依，真正做到科学的发展可以造福人类，进而产生良好的经济效益和社会效益。
2. Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College (Beijing Health-Biotech Company)
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