2022, Vol. 42引用本文 |
| 超声对Cd冲击后短程硝化污泥活性的影响 |  [PDF全文] |
短程硝化是将氨氮（NH4+-N）氧化为亚硝态氮（NO2--N），同时抑制其进一步向硝态氮（NO3--N）转化。短程硝化可作为前置环节与厌氧氨氧化工艺组合以实现高效脱氮。与传统脱氮工艺相比，其具有节约曝气量和碳源、减少剩余污泥产量的优势[1]。在现实生活中，城市污水厂会处理一定比例的工业废水，其有毒物质含量偏高，会影响生物处理工艺的稳定运行，严重时将引发系统崩溃[2-3]。镉（Cd）是一种用途广泛的金属，常用于制备颜料、塑料和陶瓷等材料[4]。在采矿、电镀、电解等工业生产过程中会排放大量含Cd废水[5]，对活性污泥系统产生巨大影响[6]。研究表明，硝化细菌易受Cd的抑制，且氨氧化菌（AOB）的敏感程度高于亚硝酸盐氧化菌（NOB）。Hu等研究发现，在Cd浓度低于1.0 mmol/L时，将抑制AOB对NH4+-N的氧化，而NOB对NO2--N的氧化不受影响[7]。Zhang等研究了Cd对短程硝化性能的影响，低浓度（低于5 mg/L）的Cd对短程硝化的影响不显著；当Cd浓度增加到10 mg/L时，AOB总数下降超过70%[8]。
研究发现，对突发性重金属超标的废水，采取化学沉淀、离子交换和膜过滤等技术去除进水中的重金属效果较差[9]。上述工艺不但不能使污泥的活性迅速恢复，还可能会产生额外的抑制作用。近年来许多学者开始研究超声波对短程硝化污泥的影响，相关研究表明，低强度超声波能有效提高短程硝化性能，强化其稳定性。Zheng等发现用超声波对污泥进行刺激后可提高AOB活性，维持短程硝化过程[10]。也有研究表明，在18 ℃时，0.25 W/mL的超声波可实现短程硝化在18 d内启动。AOB成为活性污泥的主要菌群，在低温条件下短程硝化的稳定性得到提高[11]。目前研究多侧重于低强度超声波对短程硝化污泥在启动和运行阶段的影响，而对低强度超声波对Cd冲击后短程硝化性能的影响研究较少。
本研究以性能良好的短程硝化污泥为试验对象，考察其经Cd冲击后在不同强度、运行方式和辐照时间的超声波作用下AOB和NOB活性的变化，并通过Cd的迁移转化和污泥氧化应激反应水平，进一步探究超声波与短程硝化污泥活性恢复的关系。
1 实验材料与方法 1.1 实验污泥及进水水质实验所用污泥均取自实验室已成功启动的短程硝化的序批式反应器。反应器周期运行参数为：进水5 min，反应5 h，沉淀1 h，排水5 min，其余时间静置；其中，反应阶段为“缺氧—好氧”交替运行模式，每30 min交替一次。体积交换比为50%，溶解氧约为1~2 mg/L。经过60 d的驯化后其亚硝态氮积累率（NAR）已超过85%。实验进水为自行配置的模拟污水，其化学需氧量（COD）、氨氮及总磷浓度分别为200、60、1.5 mg/L。需增加适量的碳酸氢钠，使反应器内的pH值维持在7.5~8.5之间。进水中的Cd由CdCl2·2.5H2O配制成的重金属储备液提供。
1.2 超声波装置超声波装置采用宁波新艺超声设备有限公司生产的JY88-IIN型超声波细胞粉碎机，配置ϕ6变幅杆（末端直径6 mm），最大超声波功率为250 W（比例1%~100%可调），工作频率为20 kHz。调节托盘高度，使变幅杆末端浸入污泥液面下1~2 cm，对污泥进行超声波处理。
1.3 实验方法取一定量短程硝化性能良好的活性污泥，清洗后放入2 L的烧杯中，污泥浓度（MLSS）控制在3 000 mg/L左右。在单个周期的进水中添加相应体积的重金属储备液，使Cd浓度为30 mg/L。运行结束后，排空上清液并清洗污泥。批次实验在6个250 mL锥形瓶中进行，每个锥形瓶中加入200 mL清洗后的污泥并进行超声处理，测定不同超声波强度、运行方式和辐照时间条件下，受Cd冲击后短程硝化污泥的活性污泥比耗氧速率(SOUR)。其中，不同超声波强度（处理单位体积污泥的功率）可根据污泥体积，通过改变超声波装置输出功率来进行调整。
1.4 分析测试将污泥分成若干份置于250 mL锥形瓶中进行超声处理。NH4+-N、NO2--N、NO3--N、MLSS值均参照标准方法测定。其中，NH4+-N采用纳氏试剂光度法测定；NO2--N采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法测定；NO3--N采用紫外分光光度法测定。亚硝态氮积累率（NAR）计算见式（1）。SOUR值的测定参照文献[12]。重金属含量使用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP）测定。重金属存在形态采用BCR顺序提取法提取，具体步骤参照文献[13]。重金属分布测定参照文献[14]。活性氧（ROS）水平和超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂购于上海碧云天生物技术有限公司。过氧化氢酶（CAT）和还原性谷胱甘肽（GSH）检测试剂购于南京建成生物工程研究所有限公司。
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(1) |
式（1）中：C（NO2--N）为出水亚硝态氮浓度，mg/L；C（NO3--N）为出水硝态氮浓度，mg/L。
2 结果与讨论 2.1 超声波参数对短程硝化活性恢复的影响 2.1.1 不同超声波强度对短程硝化活性恢复的影响为探究超声波强度对Cd冲击后AOB和NOB的活性恢复情况，采用6组低强度（0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 W/mL）超声波对受30 mg/L Cd冲击后的短程硝化污泥进行处理。超声处理时长为10 min，运行方式为工作1 s间歇1 s。AOB和NOB的SOUR值的变化情况如图 1所示。
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| 图 1 不同超声强度对AOB和NOB活性的影响 |
未经超声处理时，AOB和NOB的SOUR值分别为3.43、10.30 mg O2/（g MLSS·h）。经过一个运行周期的Cd冲击后，AOB对NOB活性差异优势已完全消失，说明此时短程硝化系统处于崩溃状态。随着超声波强度增大（0~0.25 W/mL），SOURAOB值呈现先增大后减小的趋势，说明低强度超声波在促进受Cd冲击的短程硝化污泥活性方面存在最佳值。当超声波强度为0.20 W/mL时，SOURAOB达到最大为9.72 mg O2/（g MLSS·h），与未经超声波处理的污泥相比提高了183.55%。当超声波强度达到0.25 W/mL时，SOURAOB值下降至5.69 mg O2/（g MLSS·h），与未经超声处理的污泥相比提高了65.91%。这表明，过高的超声波强度会打破微生物的承受极限，导致促进效果下降。有研究表明，在一定范围内AOB活性随超声波强度的增加而逐渐增加，而过高的超声波强度可能导致细胞裂解、酶失活和遗传物质损伤，从而抑制AOB的活性[15]。与AOB相比，不同超声波强度下NOB的活性变化（9.57~10.36 mg O2/（g MLSS·h））并不明显，说明短期的低强度超声处理对NOB的影响不显著。这可能是因为超声波对NOB的影响需要一定的时间才能体现出来，而类似的研究是在对污泥长期、持续性的超声波辐照下条件进行的[16-18]。结合上述实验结果，选取0.20 W/mL作为后续实验中使用的超声波强度参数值。
2.1.2 不同超声波运行方式对短程硝化活性恢复的影响为探究超声波运行方式对Cd冲击后AOB和NOB的活性恢复情况，采用不同超声波运行方式（无超声处理、工作1 s间歇1 s、工作1 s间歇2 s、工作2 s间歇1 s、工作2 s间歇2 s）的低强度超声波，对受30 mg/L Cd冲击后的短程硝化污泥进行处理，超声波强度为0.20 W/mL、超声处理时长为10 min。AOB和NOB的SOUR值的变化情况如图 2所示。
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| 图 2 不同超声运行方式对AOB和NOB活性的影响 |
未经超声处理时，AOB和NOB的SOUR值分别为3.51、6.29 mg O2/（g MLSS·h）。工作1 s间歇1 s、工作1 s间歇2 s、工作2 s间歇1 s、工作2 s间歇2 s时的SOURAOB值分别为12.81、12.57、14.58、14.95 mg O2/（g MLSS·h），与未经超声处理的污泥相比，分别提高了264.95%、258.11%、315.31%、325.88%。由此可见，随着单次超声周期工作时间延长，污泥活性明显提升，这可能是因为在适宜的范围内，超声波输入的能量同污泥活性提升呈正相关[15]。前文超声波强度参数实验也表明，0.20 W/mL的超声处理微生物是能够承受的，并具有促进活性的作用，同时未表现出明显的损伤效应。因而，在实验条件下，单次周期内工作时间越长，单次超声波输入的能量对AOB活性的提升越明显。与AOB相比，NOB的活性变化幅度较小，仅为4.73~7.65 mg O2/（g MLSS·h）。结合上述实验结果，选取工作2 s间歇2 s为后续实验中使用的超声波运行方式。
2.1.3 不同超声波辐照时间对短程硝化活性的恢复的影响为探究超声波辐照时间对Cd冲击后AOB和NOB的活性恢复情况，采用不同超声波辐照时间（0、5、10、15、20、25 min）的低强度超声波对受30 mg/L Cd冲击后的短程硝化污泥进行处理。超声强度为0.20 W/mL，运行方式为工作2 s间歇2 s。AOB和NOB的SOUR值的变化情况如图 3所示。
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| 图 3 不同超声辐照时间对AOB和NOB活性的影响 |
未经超声处理时，AOB和NOB的SOUR值分别为2.74、8.00 mg O2/（g MLSS·h）。随着辐照时间延长（0~25 min），SOURAOB值呈先增大后减小的趋势，说明低强度超声波促进受Cd冲击的短程硝化污泥活性存在最佳的辐照时间。当辐照时间为15 min时，SOURAOB值达到最大为8.80 mg O2/（g MLSS·h），与未经超声处理的污泥相比提高了220.90%。这可能是因为短时间内的超声处理所能产生的空化微泡较少，尚不足以对微生物产生明显的刺激以诱导其加快代谢。当辐照时间分别为20、25 min时，SOURAOB值分别为7.64、7.68 mg O2/（g MLSS·h），与未经超声处理的污泥相比，分别提高了178.89%、180.28%，其促进作用有所下降。文献[19]研究表明，超声波空化作用能够产生热量，短时间的超声波辐照仅使污泥温度略有上升，当辐照时间为20 min时，可使温度发生明显变化。而实验中辐照时间最长达到25 min，在此条件下，体系内的温度明显上升，酶活性开始下降。与AOB相比，不同辐照时间下NOB的活性并无明显变化，为6.88~9.48 mg O2/（g MLSS·h）。
2.2 超声波对Cd的迁移转化的影响 2.2.1 不同超声波辐照时间对细胞内外Cd分布含量变化的影响Cd在活性污泥体系内的吸附和内化，也可在一定程度上反映硝化菌受Cd的抑制及之后的恢复情况[20]。为进一步探究超声波与受Cd冲击后污泥活性恢复之间的关系，考察了不同超声波辐照时间（0、5、10、15、20、25 min）下污泥内Cd分布情况，如图 4所示。
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| 图 4 不同超声辐照时间下细胞内外Cd分布情况 |
由图 4（a）可知，随着辐照时间延长，出水中的Cd浓度明显增加，由0.659 mg/L分别提高至4.116、5.302、5.742、6.586、7.896 mg/L，这是因为超声波能够引发溶液中的微小气泡做高频率机械振动[21]，通过微泡将Cd从污泥中洗脱出来，削减了Cd在污泥中吸附和内化的程度。文献[22]研究结果也表明，低强度超声辐照有助于重金属离子从污泥中解吸出来，同时，超声波对体系产生的剧烈搅动作用促进了离子的扩散。由图 4（b）可知，前3组（0、5、10 min）细胞外Cd浓度比例为85.65%~86.97%，相应的细胞内Cd浓度比例为13.03%~14.35%，后3组（15、20、25 min）细胞外Cd浓度比例为88.50%~89.22%，相应的细胞内Cd浓度比例为10.78%~11.50%，表明在超声波的作用下出现细胞内的Cd向细胞外转移的趋势。这可能是因为在超声波加快细胞内外的传质过程中，促进了离子通道的主动运输，增强了Cd外排系统的转运能力，使细胞内部的Cd含量降低。此外，与出水中的Cd浓度变化相比，细胞外和细胞内的比例差异并不明显，这可能是因为在超声波促进细胞外部分Cd向溶液扩散的同时，还因声空化作用导致细胞膜穿孔[23]，使细胞内部分Cd直接释放到细胞外，出水Cd浓度增加，二者比例差异未发生明显改变。
2.2.2 不同超声辐照时间下Cd存在形态变化的影响BCR顺序法提取的重金属存在形态有：酸提取态（F1）、可还原态（F2）、可氧化态（F3）和残渣态（F4）。通常将F1和F2统称为不稳定态，不稳定态的比例反映了重金属迁移能力的强弱。把F3与F4统称为稳定态，反映重金属的稳定性，这两种形态迁移性较小，难以被生物体利用[24]。
为进一步探究超声波与受Cd冲击后污泥活性恢复之间的关系，考察了不同超声辐照时间（0、5、10、15、20、25 min）下污泥内Cd存在形态分布比例，如图 5所示。实验条件下的Cd浓度远超过污泥自身转化能力，短时间内来不及将F1向其他毒性更低的形态转化，因此，各组中Cd的主要存在形态均以酸提取态为主。随着辐照时间延长（5~25 min），不稳定态F1+F2比例逐渐减小，相应的稳定态F3+F4的比例逐渐增大，即污泥中Cd的流动性和生物利用度呈逐渐减弱的趋势。这可能是因为在超声波作用下，部分对超声波耐受能力差的微生物死亡，细胞内物质被释放后与重金属结合，污泥絮体结构变得更为松散，比表面积增大，吸附重金属能力增强；另一方面，超声波提高了污泥生物活性，而活性越高的微生物对重金属的吸附能力也越强[25]。在辐照时间为20、25 min时，不稳定态Cd占比有所回升。可能是随着辐照时间延长，原本已被吸附的Cd在超声波的空化作用下发生脱离，重新释放回细胞外，使小部分稳定态Cd向不稳定态转变。以上结果表明，适当延长超声波辐照时间能加快Cd由不稳定态向稳定态迁移转化，从而降低其流动性和生物利用率，减少毒性效应。
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| 图 5 不同超声辐照时间下Cd存在形态占比 |
在重金属抑制作用下呼吸电子传递链受到阻碍，大量电子被释放，同O2结合生成ROS。ROS是一类具有极高化学活性的氧自由基，包含O2-、·OH和H2O2。作为Cd冲击下的氧化应激产物，ROS水平直接反映微生物受胁迫的程度。ROS水平越高，表明其内部受到的损伤越严重，其活性也越低[26]。
为进一步探究超声与受Cd冲击后污泥活性恢复之间的关系，考察了受Cd冲击后短程硝化污泥内氧化应激效应水平的影响，测定了不同超声辐照时间（0、5、10、15、20、25 min）下污泥水平。不同辐照时间下污泥的相对ROS水平如图 6所示。可以发现，以空白组（未经超声处理）作为基准参照，经5、10、15、20、25 min的超声处理后，污泥ROS水平均有所下降，总体呈先下降后上升的趋势。超声辐照时间为5~15 min时，污泥ROS水平呈下降趋势。当超声辐照时间为15 min时，与空白组相比，污泥ROS水平下降了26.55%，为超声波组中最低值。与超声辐照15 min相比，超声辐照20、25 min时，污泥ROS水平有所上升，但比未经超声处理时低，分别下降了13.37%、17.68%。将ROS相对水平与前文不同辐照时间下SOURAOB值变化情况进行比较，二者趋势一致。因此可以认为，低强度超声波使受Cd冲击后短程硝化污泥内的氧化应激效应水平下降，是加快活性恢复的重要原因。另外，SOURAOB值变化显著高于ROS相对水平变化，这可能是因为超声波除降低氧化应激效应外，其他毒性缓解机制对污泥活性恢复亦有贡献，如前文所述的加快外排和促进其向稳定态转化。
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| 图 6 不同超声辐照时间下的ROS相对水平 |
包含抗氧化酶和非酶抗氧化物质在内的抗氧化系统是生物用于对抗氧化应激的防御机制，在清除多余的ROS中发挥至关重要的作用。SOD与O2发生歧化反应生成H2O2，再经CAT作用使H2O2分解成H2O和O2，从而实现了对ROS的清除[27]。此外，作为非酶物质的GSH，同样具有和抗氧化酶相似的清除ROS功能，在促进微生物抵抗氧化损伤方面也十分重要[28]。
为进一步探究超声波与受Cd冲击后污泥活性恢复之间的关系，考察了受Cd冲击后短程硝化污泥内抗氧化系统响应水平的影响，测定了不同超声辐照时间（0、5、10、15、20、25 min）下污泥的CAT和SOD活性、GSH含量的相对变化程度。酶活性或非酶物质含量均以空白组（未经超声处理）作为基准进行比较，其结果如图 7所示。
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| 图 7 不同超声辐照时间下抗氧化系统响应水平 |
可以看出，CAT的活性随着辐照时间延长，呈先上升后下降的趋势，与空白组相比，活性分别提高了141%、169%、214%、97%、10%，辐照时间为15 min时活性提升最多。SOD的活性随着辐照时间延长，呈先上升后下降的趋势，与空白组相比，活性分别提高了141%、169%、214%、197%、86.60%，辐照时间为15 min时活性最高。这可能是因为超声波导致酶的构象发生调整，使催化中心更易同底物接触，因而表现出更好的催化活性[29]。除此之外，也有研究表明[30]，Cd同SOD分子的直接作用会导致SOD的活性上升。短时间的超声辐照加快了体系内Cd的扩散，有助于其与SOD结合，随着辐照时间延长，在超声波产生的机械振动和高频压力条件下，同SOD结合的Cd可能出现分离，使SOD活性下降。GSH的含量随着辐照时间延长，呈先上升后下降的趋势，与空白组相比，分别提高了44%、56%、59%、60%、28%，辐照时间为20 min时提升多。这可能是因为GSH作为非酶类抗氧化物质，其合成转化受到相关酶的制约，而这类酶对超声波的反映并不一致，因此，出现峰值所对应的超声波辐照时间不同。
3 结论1）超声波能显著提高受Cd冲击后的短程硝化污泥活性。随着超声强度增大和辐照时间延长，SOURAOB值均呈先增大后减小的趋势，分别在0.20 W/mL、15 min时最大；超声运行方式为工作2 s间歇2 s时，AOB活性提升最明显。
2）低强度超声波在一定程度上促进了Cd由细胞内部向细胞外部转移，同时使Cd由不稳定态向稳定态转化，短时间内其产生的影响程度较小。
3）辐照时间为5~25 min的低强度超声波均能降低Cd冲击后污泥内的氧化应激水平，与空白组相比，辐照时间为15 min时，ROS水平最高下降了26.55%，由抗氧化系统响应水平的变化表明，超声波是通过增加微生物抗氧化酶活性和非酶类抗氧化物质含量，尤其是CAT的活性，加快清除其体内的ROS，减轻因Cd胁迫造成的氧化应激损伤。
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