2017, Vol. 23文章信息
- 贝莉莉, 廖秋艳, 陈欢儿, 谢贻冬, 周桂
- BEI Li-li, LIAO Qiu-yan, CHEN Huan-er, XIE Yi-dong, ZHOU Gui
- 响应面法优化海漆蛋白提取工艺
- Optimization of Extracting Protein from Excoecaria Agallocha by Response Surface Methodology
- 广西民族大学学报(自然科学版), 2017, 23(3): 92-96, 101
- Journal of Guangxi University for Nationalities(Natural Science Edition), 2017, 23(3): 92-96, 101
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文章历史
- 收稿日期: 2017-05-12
引用本文 |
红树林是生长于热带和亚热带海岸潮间带的一种特有的木本植物群落，是海滩上特有的森林类型[1]，也是广西北部湾民间传统药用植物[2].海漆(Excoecaria Agallocha)为红树中的大戟科常绿乔木，又名土沉香，广泛分布于我国的台湾、福建、广东、广西、海南等亚热带及热带海岸[3].药用主治体实便秘、溃疡、手足肿毒等症，目前，国内外对海漆中的二萜类化合物研究较多，但对其蛋白的提取及相关研究未见报道[4-11].
响应曲面设计方法(Response Surface Methodology，RSM)是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法[12-13].
本研究以海漆的叶子为材料，在单因素实验的基础上，设计响应面优化实验，建立蛋白提取模型，并确定提取的最佳条件，为进一步的药用价值研究提供实践和理论依据.
1 材料与方法 1.1 材料与仪器海漆叶子采自广西钦州茅尾海，并于-20 ℃冰箱保存.牛血清白蛋白、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化钾、无水乙醇、85%磷酸、盐酸、考马斯亮蓝G-250均为分析纯.
HeraeusTM Multifuge TM X1冷冻高速离心机(美国Thermo公司)；FRQ-1006HT小型超声波清洗机(浙江法兰特超声波科技有限公司)；BSA124S-CW电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；SP-723/723PC紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司).
1.2 实验方法 1.2.1 海漆蛋白提取工艺流程海漆叶子→液氮冷冻干燥→低温粉碎→加提取缓冲液→超声→4 ℃静置提取→离心→收集上清液
1.2.2 海漆蛋白提取率测定 1.2.2.1 蛋白质含量测定海漆原料中的蛋白含量参照GB / T 5009.5-2010进行测定，提取样品中的蛋白质的含量采用考马斯亮蓝法[14], 以BSA对照，绘制标准曲线，如图 1.
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| 图 1 牛血清蛋白标准曲线图 Fig. 1 The standard curve of protein content |
1.2.2.2 海漆蛋白质提取率计算
| $ 海漆蛋白提取率=\frac{样品液中蛋白含量}{原料中蛋白含量}\times 100 \% $ |
准确称取0.2 g海漆叶子粉末，以海漆蛋白质提取率为指标，以料液比(1:25、1:50、1:75、1:100、1:125、1:150、1:175、1:200、1:225、1:250、1:275、1:300、1:325、1:350)、超声时间(5、10、15、20、25、30 min)、pH(2、3、4、5、6) 为单因素进行实验，每组设置3个平行实验，结果取平均值，探讨各因素变化对海漆蛋白质提取率的影响.
1.2.4 中心组合实验在单因素实验的基础上，根据响应面实验的设计原理，选取料液比、pH值以及超声时间作为自变量，以海漆蛋白的提取率作为响应值，利用Design-Expert.V.8.0.6软件进行响应面中心组合实验设计，其因素及水平如表 1.
| 编码值 | 因素 | ||
| X1料液比(g/mL) | X2超声时间(min) | X3(pH) | |
| -1 | 1:275 | 10 | 3 |
| 0 | 1:300 | 15 | 4 |
| +1 | 1:325 | 20 | 5 |
2 结果与分析 2.1 单因素实验结果与分析 2.1.1 料液比对蛋白提取率的影响
从图 2可以看出, 随着提取液的不断增加，蛋白提取率呈明显先上升后下降的趋势，提取率在料液比为1:300时出现最大值，随后下降.分析其原因可能是随着液料比的增加，增加了固相与液相间蛋白的浓度差，有利于蛋白质的充分溶出；液料比达到一定程度后，在超声波功率恒定的情况下，液料比增加会使超声波空化作用相对降低，而使提取率下降[15-16].也可能是由于当料液比较低时，溶液的黏度较大，蛋白质不能充分浸润，分子扩散速率低，从而影响了传质过程.所以选择料液比1:300为后续实验进一步优化提取条件.
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| 图 2 不同料液比对海漆蛋白提取率的影响 Fig. 2 Effect of different feed liquid ratio on the extraction rate of Excoecaria agallocha protein |
2.1.2 pH值对蛋白提取率的影响
由图 3可看出，随着pH值的上升，提取率呈先上升后下降的趋势，在pH=4时提取率出现最高值.说明在强酸性的提取液中，海漆蛋白提取率随着pH的升高而逐渐增大，在提取液呈弱酸至中性时，海漆蛋白提取率随着pH的增高呈下降趋势.其原因可能是海漆蛋白在强酸性条件下蛋白析出较好，溶解度高，而在pH=4之后，pH的增高会使蛋白难以析出或者会破坏蛋白质，因此提取率会随着pH值的上升呈下降趋势[17-18].所以选择pH=4作为后续实验进一步优化提取条件.
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| 图 3 不同pH对海漆蛋白提取率的影响 Fig. 3 Effect of different pH on the extraction rate of Excoecaria agallocha protein |
2.1.3 超声时间对蛋白提取率的影响
由图 4可知，随着超声时间的增加，提取率呈先上升后下降的趋势，在超声时间为15 min时出现最高提取率.其原因可能是随着时间的增加，在超声波作用下海漆细胞破碎程度渐渐增大，蛋白质溶出量渐渐增加.但超声波作用时间过长会影响蛋白质的活性，提取时间超过15 min后对蛋白质的破坏程度加大，从而影响提取率[19-20].所以选择超声时间15 min作为后续实验进一步优化提取条件.
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| 图 4 不同超声时间对海漆蛋白提取率的影响 Fig. 4 Effect of different ultrasonic time on the extraction rate of Excoecaria agallocha protein |
2.2 中心组合实验结果分析
响应面分析实验的结果见表 2，对数据进行回归分析后得到海漆蛋白质(Y)的回归方程为：
| 序号 | X1料液比 | X2pH | X3超声时间(min) | Y提取率(%) |
| 1 | 0.30 | 4 | 20 | 54.5833 |
| 2 | 0.33 | 4 | 15 | 51.6176 |
| 3 | 0.33 | 4 | 15 | 51.7938 |
| 4 | 0.36 | 3 | 15 | 40.1577 |
| 5 | 0.36 | 4 | 20 | 50.622 |
| 6 | 0.33 | 3 | 10 | 35.9991 |
| 7 | 0.33 | 5 | 20 | 46.0983 |
| 8 | 0.30 | 3 | 15 | 54.1099 |
| 9 | 0.30 | 5 | 15 | 46.9783 |
| 10 | 0.33 | 3 | 20 | 42.1056 |
| 11 | 0.33 | 4 | 15 | 47.9772 |
| 12 | 0.36 | 4 | 10 | 41.7185 |
| 13 | 0.30 | 4 | 10 | 50.2672 |
| 14 | 0.33 | 5 | 10 | 39.212 |
| 15 | 0.33 | 4 | 15 | 46.2157 |
| 16 | 0.36 | 5 | 15 | 37.0359 |
| 17 | 0.33 | 4 | 15 | 47.3313 |
Y=48.99-4.55X1-0.88X2+3.28X3+2X1X2+1.15X1X3+0.19X2X3+2.01X12-6.43X22-1.70X32
对该模型进行方差分析，从表 3可以看出，模型显著，并且失拟项P=0.1172＞0.05，不显著，说明该模型成立.该模型的回归决定系数R2=0.9279表明响应值的变化有92.79 %来自所选择因素的变化，RAdj2=0.9067表明该模型可以解释90.67 %响应值的变化.说明该模型与实际实验的拟合较好，可用于海漆蛋白提取工艺的分析和预测.
| 来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 | 显著性 |
| 模型 | 481.24 | 9 | 481.24 | 3.74 | 0.0479 | 显著 |
| X1料液比 | 165.66 | 1 | 165.66 | 11.60 | 0.0114 | |
| X2pH | 6.21 | 1 | 6.21 | 0.43 | 0.5308 | |
| X3超声时间 | 85.89 | 1 | 85.89 | 6.01 | 0.0440 | |
| X1X2 | 16.04 | 1 | 16.04 | 1.12 | 0.3245 | |
| X1X3 | 5.26 | 1 | 5.26 | 0.37 | 0.5631 | |
| X2X3 | 0.15 | 1 | 0.15 | 0.011 | 0.9207 | |
| X12 | 17.07 | 1 | 17.07 | 1.20 | 0.3105 | |
| X22 | 174.10 | 1 | 174.10 | 12.19 | 0.0101 | |
| X23 | 12.21 | 1 | 12.21 | 0.85 | 0.3860 | |
| 残差 | 100.01 | 7 | 100.01 | |||
| 失拟项 | 73.77 | 3 | 24.59 | 3.75 | 0.1172 | 不显著 |
| 纯误差 | 26.24 | 4 | 6.56 | |||
| 总和 | 581.25 | 16 | ||||
| R2=92.79% | RAdj2=90.67% |
根据数据分析可知，各因素对海漆蛋白提取率的影响并非是简单的线性关系.通过直接比较回归方程中一次项系数的大小来确定影响海漆蛋白提取率的因素主次性，得到各因素对海漆蛋白提取率的主次性从大到小依次为：料液比＞超声时间＞pH.
2.3 响应面结果分析根据二次多项式回归方程做出的响应面和等高线图如图 5~7所示.
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| 图 5 超声时间和pH交互作用对海漆蛋白质提取率的影响 Fig. 5 Effects of ultrasonic time and pH on protein yield |
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| 图 6 料液比和pH相互作用对蛋白提取的影响 Fig. 6 Effects of material/liquid ratio and pH on protein yield |
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| 图 7 料液比和超声时间相互作用对蛋白提取的影响 Fig. 7 Effects of material/liquid ratio and ultrasonic time on protein yield |
由图 5可知，当料液比等因素固定不变时，超声时间和pH的交互作用对蛋白提取率有显著影响.当超声时间固定不变时，海漆蛋白质的提取率随着pH的升高而呈先上升后下降的趋势.在pH=4的条件下，海漆蛋白质的提取率随着超声时间的延长而升高.在pH较低和较高的条件下，海漆蛋白质的提取率随着超声时间的延长略微呈先升高后有所下降的趋势.
由图 6可知，超声时间等因素固定不变时，料液比和pH的交互作用对蛋白质提取率有显著影响.在较高或者较低料液比的条件下，海漆蛋白质的提取率随着的升高而呈先上升后下降的趋势较为明显.当pH固定不变时，海漆蛋白质的提取率则随着料液比的变化呈先下降后上升的趋势，其趋势在pH=4的条件下最为显著.
由图 7可知，pH等因素固定不变时，料液比和超声时间的交互作用对蛋白质提取率有显著影响，当料液比固定不变时，海漆蛋白提取率随着超声时间的延长而升高，且在较高料液比的条件下提取率较高.当超声时间固定不变时，海漆蛋白的提取率随着料液比的升高而升高，且在较长的超声时间下的趋势较为显著.在较高料液比和较长超声时间的作用下提取率达到较高值.
2.4 验证实验通过所得回归模型对提取工艺进行优化获得的最佳超声提取工艺条件为：液料比1:300，pH=3.81，超声时间16.89 min，根据实际操作条件调整为：液料比1:300，pH=3.8，超声时间17 min，在此优化条件进行验证实验并设置3个平行组，测得海漆蛋白提取率为56.34±0.08 %，与预测值56.10 %基本一致.由此可见，采用响应面分析法对海漆蛋白超声提取工艺的优化是行之有效的.
3 结论通过使用响应面分析法优化海漆蛋白提取过程中的提取率参数，借助Design-Expert.V.8.0.6软件进行二次旋转正交分析，得到二次多项式回归模型(R2=0.9279)，确定海漆蛋白的最佳提取工艺为：料液比为1:300，pH=3.8，超声时间为17 min，提取率可达56.34 %.
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