厌氧发酵是一种能减少有机污染物的同时产生生物能源的有效方法，世界各地均有广泛应用[1, 2]。沼气发酵是在厌氧条件下，有机质经微生物发酵产生沼气的过程，分为水解、酸化、乙酸化和甲烷化4个阶段[3]。甲烷化有两条反应路径：
| ${\rm{C}}{{\rm{H}}_{\rm{3}}}{\rm{COOH}} \to {\rm{C}}{{\rm{H}}_{\rm{4}}}{\rm{ + C}}{{\rm{O}}_{\rm{2}}}{\rm{,}}\Delta {G^{Ɵ}}{\rm{ = -31}}\,{\rm{kJ}} \cdot {\rm{mo}}{{\rm{l}}^{ - {\rm{1}}}}$ | (1) |
| ${\rm{C}}{{\rm{O}}_{\rm{2}}}{\rm{ + 4}}{{\rm{H}}_{\rm{2}}} \to {\rm{C}}{{\rm{H}}_{\rm{4}}}{\rm{ + 2}}{{\rm{H}}_{\rm{2}}}{\rm{O,}}\Delta {G^{Ɵ}}{\rm{ = -136}}\,{\rm{kJ}} \cdot {\rm{mo}}{{\rm{l}}^{ - {\rm{1}}}}$ | (2) |
沼气中的甲烷约70%来自于路径(1)，此时CH4和CO2产生比例为1:1，CH4浓度只能占50%，而路径(2) 的气相产物只有CH4，且从热力学角度来看，路径(2) 也更为有利，但往往由于H2的限制，路径(2) 产甲烷贡献只占30%[3~5]。因此，沼气中一般含有60%~70%的CH4，30%~40%的CO2以及H2S、CO和H2O等其他微量气体。沼气能量密度低，通常只用于发电和供热。将其进行提纯(脱碳)后，CH4的含量达到90%以上，升级为生物甲烷，可作为天然气的替代品并入现有天然气管网，作民用或工业用燃料，也可用作车用燃料[6, 7]，极大地拓宽了用途。
目前发展较成熟的沼气提纯技术主要有水洗法、变压吸附法、膜分离法和物理化学吸收法等[8~10]，这些技术需额外投加处理设备，投资大、能耗高，削弱了经济竞争力[11]。另外，这些技术在沼气提纯过程中，小部分CH4也随着CO2一起排放到大气中，不仅造成资源浪费，同时这部分温室气体也影响了环境[12]。为克服以上这些不利之处，近些年有学者通过向沼气厌氧发酵体系中添加外源H2，目的在于利用食氢产甲烷菌的生物活动，原位转化CO2合成CH4，提高路径(2) 的甲烷贡献率；同时降低沼气中CO2浓度，提高沼气中甲烷的浓度，实现沼气的提纯[13~15]。外源H2也是一种清洁能源，但其热值仅约为CH4的1/4，运输储存成本却是CH4的3倍左右[16]，所以通过外源H2的通入提高沼气中CH4纯度，前后并没有造成多大的能量损失，又使能源利用更便捷、更广泛。此外，外源H2的获得可以通过可再生能源电解水得到[14]，也可通过其他资源获得，比如煤气、石油精炼厂、石化工厂和碳酸饮料制造厂等[17]，进一步降低该技术的成本。
此前，课题组已建立一套利用外源H2原位脱除CO2提纯沼气的小试装置，并取得初步研究成果[18]，但该装置中外源H2的通入未能实现连续化，这导致外源H2的利用率不高，也缺乏对于技术工业应用的指导意义。本文在此基础上，重新设计并建立了能连续导入外源H2的小试装置，选择水稻秸秆为发酵底物，分别在中温发酵和高温发酵条件下，探索外源H2通入量对厌氧发酵过程中产气规律和沼气组成的影响和外源H2利用率，初步分析外源H2导入对发酵体系中挥发性脂肪酸(VFAs)等参数的变化。
2 材料与方法 2.1 实验材料本文使用的水稻秸秆取自浙江省建德市下涯镇联合村，秸秆的总固体(TS)为(91.0±0.3)%，挥发性固体(VS)为(77.6±0.6)%，使用前用粉碎机将其粉碎。沼液取自杭州正兴牧业有限公司浙江大学奶业科学研究所实验牧场，TS为(3.6±0.1)%，VS为(1.9±0.1)%。
2.2 实验装置及说明实验装置如图 1所示，沼气发酵装置由1 L的发酵瓶构成，工作体积为600 mL。加入40.8 g秸秆和300 mL沼液，并用水稀释至600 mL，控制TS为(8±0.1)%，橡胶塞密封后用氩气驱赶瓶内残余空气，使之完全处于厌氧状态；发酵瓶置于恒温水浴锅中，分别在中温(35±1)℃和高温(55±1)℃条件下发酵。来自钢瓶的H2首先连接转子流量计，用于初步控制和稳定H2的流量，然后经蠕动泵计量后由分气头均匀分流至三个发酵瓶中。其中，蠕动泵流量由皂膜流量计预先校验。根据发酵系统中食氢产甲烷路径H2与CO2之间的化学计量关系(1 mol CO2转化为CH4需要4 mol H2)确定H2的通入量分别为CO2产生量的4、5和6倍。根据前期预实验沼气产量及CO2的含量，中温发酵条件下H2的通入量分别为1070、1330和1600 mL·L-1·day-1，高温发酵条件下分别为2130、2670和3200 mL·L-1·day-1。每组设置三个平行，并设置不通外源H2的对照组。发酵周期为36 d，每日沼气产生量通过小型顶空罐计量。
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图 1 厌氧发酵实验小试装置示意图 Fig.1 Schematic diagram of the batch fermentation setup (② and ③ device were the same as ①) 1. rotor flowmeter 2. peristaltic pump 3. gas distribution device 4. water bath thermostat 5. fermentation bottle 6. biogas collection |
秸秆和沼液的TS、VS根据美国公共卫生协会(APHA)水和废水检验的标准方法[19]测得。批试结束后发酵液经离心过滤并检测其pH和VFAs。用便携式pH计(雷磁PHB-4) 测量pH，气相色谱法(GC-6890N，Agilent Technologies)测定VFAs浓度，采用火焰离子化检测器(FID)和FFAP毛细管柱。
每周2次采顶空集气罐中沼气样，并用气相色谱(GC-1690，科晓)测定其中CH4、CO2和H2的体积分数，采用TDX-01和5A分子筛填充柱以及热导检测器(TCD)。
为消除外源H2残留对沼气产量的影响，沼气的实际产量可用下式修正：
V*=(1-y)V
其次，较大量残留的外源H2将影响沼气中各组分体积分数，因此将扣除残留的H2、N2、H2S、H2O等杂气后所得CH4和CO2的体积分数定义为CH4和CO2的相对体积分数，以CH4*和CO2*表示。
3 结果与讨论 3.1 外源H2的通入量厌氧发酵体系中沼气各组分体积分数变化如图 2所示。对照组中，平均CH4相对体积分数分别约为61.3% (中温发酵)、61.1% (高温发酵)。4、5及6倍的外源H2通入量下，沼气中CH4相对体积分数分别增加到68.6%、73.3%、74.7% (中温发酵)与71.4%、81.9%、83.4% (高温发酵)，CO2相对体积分数分别降至31.4%、26.7%、25.3% (中温发酵)与28.6%、18.1%、16.6% (高温发酵)。在微生物作用下，外源H2与厌氧发酵产生的CO2原位合成CH4。沼气中CO2浓度的降低和甲烷浓度的提高，实现了沼气的提纯。
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图 2 中温(a、b、c)发酵和高温(d、e、f)发酵沼气中各组分变化图 Fig.2 Biogas composition at mesophilic (a, b, c) and thermophilic (d, e, f) fermentation conditions a, d: 4 times of H2 b, e: 5 times of H2 c, f: 6 times of H2) |
由式(2) 可知，H2与CO2以4:1的比例生成CH4，因此理论上通入4倍的外源H2为宜，但由于H2气液传质的限制，实际适宜的外源H2通入量需要经过实验来确定。从上图中可以看出，随着外源H2通入量的增加，CH4相对体积分数也呈现逐步递增的趋势。其中，5倍通入量较4倍通入量提纯效果明显，相比之下，6倍较5倍通入量效果无明显提高。另一方面，从CH4产量来看(图 3)，通入外源H2的发酵体系CH4产量均高于对照组，但并不与通入量成正比，外源H2通入量为CO2产生量5倍时CH4产量最高，当外源H2通入量增加至6倍时，CH4产量反而有所减少。
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图 3 中温发酵和高温发酵CH4产量图 Fig.3 Methane yields in mesophilic and thermophilic fermentation reactors |
分析其原因，当通入量为4倍时，由于H2难溶于水，气液传质速率小，外源H2不能完全被利用；当通入量增加至5倍时，强化了气液传质速率，溶于发酵体系从而被微生物利用的外源H2增加，CH4的产量和体积分数均随之提高；然而当外源H2通入量继续增加为6倍时，发酵罐内气泡聚并严重，使单位液体体积中的气泡数目减少，气液传质速率可能随着气体流量的增大先呈增大趋势，到一定值时继而呈减小趋势[20]，故此时CH4体积分数并未有明显提高，甚至CH4产量较5倍时反而有所减少。另外，当外源气体通入量增加为6倍时，沼液pH升高呈碱性环境，不利于厌氧发酵。综上所述，5倍的外源H2通入量为最佳通入量。
3.2 外源H2转化率与利用率如前所述，外源H2的利用取决于气液传质速率，这决定了通入发酵瓶的外源H2不能完全转化或利用，少部分残留在沼气中。根据外源H2的通入量和沼气中H2的残余量，可以计算出外源H2消耗量，消耗量与通入量的比值定义为外源H2转化率，公式如下：
| $T = \frac{{A - R}}{A} \times 100\% $ |
通过对比对照组和实验组的CH4产量，可估算出消耗的外源H2中实际被用于转化为CH4的量，将此被利用的量与通入量的比值定义为外源H2利用率，公式如下：
| $U = \frac{{\left( {{P_{\rm{t}}} - {P_{\rm{c}}}} \right) \times 4}}{A} \times 100\% $ |
外源H2转化率与利用率如表 1所示，结果表明二者非常接近，说明消耗的外源H2几乎全部转化为CH4，CH4产量的增加来源于外源H2的通入。
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表 1 外源H2转化率与利用率 Table 1 Conversion and utilization of exogenous H2 |
表 1可见，随着外源H2通入量的增加，H2转化率并不是呈正相关，当外源H2通入量为5倍时，转化率达到最高，再次验证此时外源H2的气液传质速率最强，当通入量增加至6倍时，外源H2转化率急速下降，造成H2能源的浪费。综合考虑，虽然6倍的外源H2通入量使得CH4体积分数有所提高，但相比较5倍外源H2来说，提高程度不明显，却造成H2的浪费，因此外源H2通入量为5倍为宜。
3.3 中温发酵和高温发酵对比外源H2的通入，中温和高温发酵体系中均实现CH4体积分数的显著提高。然而，与中温发酵相比，高温发酵外源H2利用率增加不多，但沼气中CH4相对体积分数却明显高于中温发酵。另一方面，对比沼气总产量(图 4)，中温发酵也不及高温发酵。比较两者发酵后沼液的VS(中温发酵9.8%，高温发酵9.0%)，高温发酵比低温发酵多出8%生物质被分解，说明有机质在高温情况下更容易被降解，高温发酵较中温发酵更有优势，这与其他研究者结果一致[21]。一般情况下，随着温度的升高，微生物活性增强，发酵产气效率也随之提高[22]。因此高温发酵有更高的沼气产量和CH4产量，CH4体积分数也更高。
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图 4 不同温度和外源H2通入量下的总产气量 Fig.4 Total biogas yields under different exogenous gas fluxes at 35℃ and 55℃ |
发酵结束后，发酵液的pH和其中VFAs浓度如表 2所示，结果表明液相中的VFAs未发现明显累积，乙酸、丙酸、异丁酸和正丁酸都维持在相对较低水平，较对照组反而降低。外源H2的通入丰富了发酵系统中同型产乙酸菌，并使氢营养菌处于优势地位[23]，所以外源H2的通入并没有抑制VFAs的降解，反而提高了沼气中的CH4含量。沼液中CO2主要是以碳酸氢盐(酸式碳酸盐)的形式存在[24]，过量外源H2通入使得食氢产甲烷菌消耗大量碳酸氢盐，导致沼液pH升高[14, 15]，形成不利于厌氧发酵产沼气的偏碱性的环境。
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表 2 中温和高温厌氧发酵后沼液中pH和VFAs数据表 Table 2 pH and VFAs after mesophilic and thermophilic anaerobic fermentation |
中温或高温沼气发酵系统中，外源H2的引入能有效提高系统中沼气产量和CH4的相对体积分数，其中CH4相对体积分数随外源H2通入量的增加而增加，合适的外源H2通入量确定为体系中CO2产生量的5倍。相比对照组，此通入量下CH4的体积分数分别提高了20%和34%，实现了沼气的原位提纯。通入沼气发酵系统的外源H2能被充分地转化和利用，在最佳外源H2通入量下，中温和高温条件下外源H2利用率分别达到79%和85%。与中温发酵相比，高温发酵外源H2利用率增加不多，但高温发酵沼气中CH4相对体积分数明显高于中温发酵，最大高出12%，沼气产量和CH4产量也相对较高，高温发酵更具优势。外源H2的导入会使发酵系统pH升高而不利于沼气发酵，但明显改善了发酵液中VFAs的累积问题，从而有利于沼气发酵。
符号说明：
| A | —外源H2通入量，mL·L-1·d-1 | U | —外源H2利用率，% |
| Pc | —对照组CH4产量，mL·L-1·d-1 | V | —修正前的沼气产量，mL·L-1·d-1 |
| Pt | —实验组CH4产量，mL·L-1·d-1 | V* | —修正后的沼气产量，mL·L-1·d-1 |
| R | —沼气中残余H2量，mL·L-1·d-1 | y | —沼气中残余H2量的体积分数，% |
| T | —外源H2转化率，% |
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