1 前言

农作物秸秆是重要的可再生资源^[1]，我国每年的秸秆产量高达7亿多吨，这些资源长期以来不但没有得到合理利用，反而常常造成环境污染。农作物秸秆中含有大量有机质以及氮、磷、钾和微量元素，通过微生物的腐解可为农田提供优质的有机肥料^[2]。秸秆还田作为植物纤维废弃物综合利用的主要措施之一，对于增加土壤肥力、减少化肥使用量、改善农业生态环境具有重要作用。然而自然条件下，仅仅依靠环境中的微生物分解秸秆速度缓慢，大量秸秆直接还田后不仅会影响土壤的物理性状和下茬作物的种植，还会导致植物病害^[3]；而焚烧秸秆不但浪费资源，而且会造成严重的环境污染，因此农作物秸秆合理利用的问题亟待解决。

秸秆的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，尽管使用酶制剂(纤维素酶、漆酶、木聚糖酶等)可加速秸秆分解，但是成本太高，无法实际推广应用。基于秸秆还田实施过程中面临的具体问题，近年来秸秆腐熟菌剂的研究方兴未艾。目前已有的秸秆腐熟菌剂通常由土壤中筛选出的细菌(主要为芽孢杆菌)和真菌(酵母菌、木霉、曲霉)所组成，由不同菌种分别单独培养后再按一定比例混合复配。已有试验结果表明^[4-6]，秸秆腐熟菌剂对于秸秆的腐熟分解确有明显的促进作用，但面临的问题是：涉及到的多个微生物的发酵制种工艺比较繁琐，生产成本偏高；在具体使用过程中不同菌种之间可能发生相互竞争或拮抗作用，对菌种的生长发育产生不良影响；而且目前所采用的菌种产酶水平不高，酶系单一(主要是内切型-β-葡聚糖酶)，难以对秸秆的木质纤维素结构实施高效降解，以至于秸秆腐熟过程太长(通常要20d以上)，技术水平有待进一步提高。

已有研究报道，漆酶与纤维素酶间存在协同作用，可以有效提高木质纤维素降解效率^[7-9]。本实验室在前期研究工作中，将血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)的漆酶基因经过密码子优化后，导入里氏木霉的分生孢子中，成功地获得了基因重组转化子^[10]。已构建的重组里氏木霉不但可以分泌高活力的漆酶，同时还保持了原有的、能生产出高活力纤维素酶和木聚糖酶的性能。由于重组里氏木霉易于培养，利用其优良的产酶性能以及可产生大量分生孢子的特性，可以简化菌种制作及接种过程，非常适宜于秸秆基质的固体发酵。

本文拟在前期研究工作的基础上，进一步将重组里氏木霉用于秸秆的快速降解研究。旨在提升现有的秸秆还田技术，改善生态环境，促进农业生产可持续健康发展。

2 实验材料和方法 2.1 菌种

里氏木霉(Trichoderma reesei) ZU-02、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均为本实验室保藏菌种。

重组里氏木霉(T.reesei ZJ-09)带有来自血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)的耐高温漆酶基因，由本实验构建^[11]，保存于PDA斜面培养基上。

2.2 水稻秸秆预处理

稻草取自杭州郊区农田，其中纤维素、半纤维素和木质素的含量分别为37.27%、20.50%和14.10%，其他成分(矿物质、果胶、蛋白质、可溶性糖等)含量合计为28.13%^[12]。

将水稻秸秆切成2~5 cm左右，按1:10的固液比与10%的氨水混合，室温下浸泡24 h，抽滤并淋洗除去残留氨。氨水处理后稻草中纤维素、半纤维素和木质素含量分别为47.50%、22.60%和13.20%。

2.3 重组里氏木霉对水稻秸秆的降解试验 2.3.1 重组里氏木霉孢子悬浮液的制备

将重组里氏木霉接种到PDA斜面上，30℃培养5d后取出。向斜面中加入20 mL无菌水，接种针轻轻刮下孢子，制成孢子悬浮液，控制孢子浓度为10⁸个·mL^-1。

2.3.2 重组里氏木霉降解水稻秸秆

以水稻秸秆为重组里氏木霉固体发酵的主要基质，并按重量比加入25%麸皮、2% (NH4)₂SO₄、0.5%尿素、0.5% CaCl₂、0.5% KH₂PO₄、0.25%MgSO₄·7H₂O、0.05% CoCl₂和0.025% CuSO₄，混合后按试验要求加入适量水分(通常基质含水量控制在70%左右)。

水稻秸秆的降解试验在500 mL三角瓶或50cm×30 cm塑料盘中进行，秸秆基质厚度为4~7 cm，将重组木霉分生孢子悬浮液(每mL含10⁸个孢子)按10%比例(1mL/10g秸秆基质)接入秸秆基质中，在一定湿度、温度下培养2~14d。定期取样检测发酵基质中菌种的生长、产酶以及秸秆的降解情况，其中秸秆降解情况以各组分降解率表示，以纤维素为例，降解率计算公式如下：

$ D = \frac{{{S_0} \times {C_0} - {S_1} \times {C_1}}}{{{S_0} \times {C_0}}} \times 100\% $

式中，D为纤维素降解率，%；S₀为降解前秸秆质量，g；S₁为降解后秸秆质量，g；C₀为降解前秸秆中纤维素含量，%；C₁为降解后秸秆中纤维素含量，%。

2.4 分析测定方法 2.4.1 粗酶液制备

称取5 g酶曲，加入250 mL柠檬酸缓冲溶液(pH=4.8)，室温下浸泡24 h，8000 r·min^-1、4℃条件下离心2 min，取上清液得到粗酶液。

2.4.2 滤纸酶活力测定

滤纸酶活力(代表纤维素酶的总活力)测定采用国际纯化学与应用化学联合会推荐的方法测定^[13]，以Whatman No.1滤纸为底物(1cm×6 cm)，加入0.5 mL适当稀释的酶液、1 mL柠檬酸缓冲溶液(pH=4.8)，50℃水浴反应30 min后测定还原糖含量。一个滤纸酶活力(FPA)国际单位定义为：在标准反应条件下，每分钟生成1 μmol葡萄糖(以还原糖计)所需的酶量，以IU·mL^-1或IU·g^-1表示。

2.4.3 漆酶活力测定

漆酶活力测定采用ABTS法^[14]，以2, 2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物。取50μL酶液，加入950 μL柠檬酸缓冲溶液(pH=4.0)，再加1 mL ABTS溶液(2 mmol·L^-1)，30℃反应2 min，测定420 nm下吸光值随时间的变化。一个漆酶活力国际单位(IU)定义为：每分钟消耗1 μmol ABTS的酶量(摩尔吸光系数ε=36000 L•mol^-1•cm^-1)。

2.4.4 内切型-β-葡聚糖酶(CMC酶)活力测定

用pH值为6.0的柠檬酸缓冲液配制的1%羧甲基纤维素钠(CMC，购自Sigma公司)溶液1 mL与0.5 mL适当稀释的酶液混合, 在50℃水浴反应15 min后，测定还原糖含量。定义标准反应条件下每分钟由底物产生1 μmol葡萄糖(以还原糖计)所需酶量为一个酶活单位，以IU·mL^-1或IU·g^-1表示^[15]。

2.4.5 木聚糖酶活力测定

取0.5 mL适当稀释的粗酶液，加入1 mL 0.05 mol·L^-1柠檬酸缓冲溶液(pH=4.8)及l mL 1.2%木聚糖底物，在50℃水浴反应30 min后测定还原糖含量^[16]。空白试验中除酶液事先灭活外，其余条件不变。定义每分钟分解底物释放出1 μmol木糖(以还原糖计)所需的木聚糖酶量为一个活力单位，以IU·mL^-1或IU·g^-1表示。

2.4.6 还原糖含量

还原糖含量测定采用DNS (3, 5-二硝基水杨酸)法^[13]。

2.4.7 水稻秸秆成分分析

纤维素、半纤维素、木质素含量测定参考文献17，准确称取0.5000 g秸秆(粉碎后过50目筛)置于100 mL碘量瓶，加入50 mL中性洗涤液后放入已沸的高压蒸汽灭菌锅，100℃保温1 h后取出，用3号砂芯漏斗过滤。取滤渣先经水洗后再用丙酮洗，置于100 mL碘量瓶中，加入50 mL浓度为2 mol·L^-1的HCl，放入已沸的高压蒸汽灭菌锅中，100℃保温50 min后取出，用3号砂芯漏斗过滤，用DNS法测出滤液中还原糖含量，乘以系数0.9即可得到半纤维素的含量。

将第二次过滤产生的滤渣水洗至中性再用丙酮洗，60℃烘干后置于50 mL烧杯中，加入5 mL 72%硫酸，20℃水解3 h后加入45 mL水，室温过夜后过滤，蒽酮法测定滤液中的总糖含量，乘以系数0.9即可得到纤维素的含量。

将第三次过滤得到的滤渣水洗至中性后，105℃烘干至恒重，然后置于马弗炉中550℃下灰化，灰化前后质量差即为木质素的质量。对比处理前后秸秆中纤维素、半纤维素和木质素含量即可得到各组分脱除率。以纤维素为例，计算公式如下：

$ R = \frac{{{P_0} \times {C_0} - {P_1} \times {C_1}}}{{{P_0} \times {C_0}}} \times 100\% $

式中，R为纤维素脱除率，%；P₀为氨水处理前秸秆质量，g；P₁为氨水处理后秸秆质量，g；C₀为氨水处理前秸秆中纤维素含量，%；C₁为氨水处理后秸秆中纤维素含量，%。

2.4.8 基质含水率的测定

精确称取一定质量(m₁)的秸秆基质，105℃烘干至恒重后测得秸秆基质质量(m₂)，秸秆基质中的含水率$ = \frac{{{m_1} - {m_2}}}{{{m_1}}} \times 100\% $。

3 结果与讨论 3.1 影响水稻秸秆降解的主要因素 3.1.1 氨水预处理

纤维原料致密复杂的结构及纤维素分子高度结晶特性，使得农作物秸秆的利用受阻，适当的预处理，可以降低纤维素的结晶度、增加纤维原料的多孔性、脱除木质素的保护作用^[18]。对比处理前后的稻草组分可以发现，氨水处理后稻草的总失重率为21.6%，其中半纤维素脱除率为13.5%，木质素脱除率为20.96%。

利用氨水预处理，可以在常温条件下去除秸秆中的部分木质素，同时还可有效去除秸秆中的乙酸盐、糖醛酸以及一些碱溶性提取物^[19-20]，致使秸秆基质的通透性加大、纤维素的比例相对提高，有利于进一步利用微生物或酶对其进行降解。

将秸秆作为重组里氏木霉固态发酵的底物，可以明显观察到经氨水预处理过的秸秆上，重组里氏木霉生长更快。分析对比氨水预处理前后的秸秆在固态发酵第10天各组分的变化情况，发现预处理后秸秆纤维素、半纤维素、木质素的降解率均高于未经预处理的秸秆，前者总失重率达53.45%，而后者总失重率为30.06% (图 1)。

3.1.2 温度

将重组里氏木霉接入氨水预处理后的秸秆基质(含水率70%)中，在不同温度条件下进行固态发酵，图 2显示了发酵第10天秸秆基质的降解率以及漆酶、纤维素酶活力数据。

试验结果表明，当发酵温度为30℃时，漆酶和纤维素酶活力较高，此时秸秆总失重率为53.45%。当发酵温度在24~32℃的范围内变化时，漆酶和滤纸酶活力只出现轻微波动，秸秆总失重率在46.84%~53.45%的范围内变化，相关数据利用SPSS进行统计检验分析，所得显著性P值> 0.1，说明不同温度下稻草降解率无显著差异，也表明重组木霉对外界温度变化的适应性较强。

3.1.3 基质含水量

将重组里氏木霉接种到氨水预处理后的秸秆基质上，在不同的基质含水率条件下30℃固态发酵10d，秸秆基质中漆酶、滤纸酶活力以及稻草降解率如图 3所示。从图 3可以发现，重组里氏木霉在含水量70%的秸秆基质中酶活力及秸秆降解率最高，但在含水量60%~75%范围内，稻草降解率仅变化了3.73%。在固态发酵过程中，秸秆降解会产生一定的水分^[20-21]，重组里氏木霉菌丝在秸秆上的缠绕、覆盖也具有一定的保水作用。若应用于野外秸秆降解试验，土壤对于秸秆基质的含水量会有一定的缓冲作用，所以重组里氏木霉对秸秆基质含水量的要求比较宽松，这一特点有利于该菌种在野外实际应用中发挥作用。

3.1.4 菌种

将重组里氏木霉(T.reesei ZJ-09)、里氏木霉(T.reesei)ZU-02和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)分别接种于氨水预处理后的水稻秸秆基质上，在发酵的第10天对比稻草降解结果(图 4)。

由图 4 (a)可见，与出发菌株里氏木霉(T.reesei) ZU-02比较可以发现，T.reesei ZJ-09固态发酵第10天，滤纸酶、CMC酶和漆酶活力分别为120.96、1313.15和8.11 IU·g^-1。虽然T.reesei ZU-02的滤纸酶活力稍高于T.reesei ZJ-09，但T.reesei ZJ-09分泌的漆酶可以作用于稻草中的木质素，有利于水稻秸秆中纤维素和半纤维素的水解(图 4 (b))。由图 4 (b)可见，发酵第10天，T.reesei ZJ-09降解秸秆的总失重率高达53.45%，明显高于T.reesei ZU-02的36.76%，其中纤维素、半纤维素和木质素降解率分别为77.93%、55.12%和31.52%。

Bacillus subtilis是目前用于秸秆腐熟的常用菌种，尽管它也可以产漆酶和纤维素酶，但酶活远低于T.reesei ZJ-09，发酵第10天秸秆总失重率仅为12.63% (图 4 (b))；除了降解效率低，细菌类秸秆腐熟剂降解秸秆过程中对温度和湿度的要求都比较高，因此实际使用中需要在耕地中大量灌水，保持厌氧和高湿环境，对于玉米小麦等旱地作物则需要建造降解池。有专利公开了一种由荧光假单胞菌、蜡质芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和环状芽孢杆菌组成的秸秆腐熟剂，需要30 d左右才能对秸秆实行有效的降解^[22]。Niu Dongze等人^[23]利用白腐菌降解小麦秸秆，固态发酵28 d后，纤维素、半纤维素降解率分别为20%、46%，总失重率为22%。Xu等人^[24]以小麦秸秆、水稻秸秆、甘蔗渣等生物质为底物固态发酵，获得CMC酶、滤纸酶和β-葡萄糖苷酶活力分别为27.15、3.16和2.53 IU·g^-1。

本试验采用的T.reesei ZJ-09不但可以分泌高活力的漆酶，同时还保持了原有的生产高活力纤维素酶和木聚糖酶的性能，秸秆总失重率较T.reesei ZU-02和Bacillus subtilis分别提高了45.40%和76.37%，在秸秆快速降解方面具有良好的应用前景。

3.2 重组里氏木霉在秸秆基质中的产酶进程

以秸秆为原料，采用重组里氏木霉进行固态发酵，定时取样检测发酵基质中的酶活力。对照图 5(a)、(b)可见，未经氨水预处理的秸秆的最终达到的酶活力(纤维素酶、木聚糖酶、漆酶)与经氨水预处理过的秸秆的结果相似，但发酵周期延长。因为未经氨水预处理的秸秆结构致密，纤维素、半纤维素和木质素有机结合成刚性结构，阻碍了重组里氏木霉对秸秆的利用。研究结果还表明(图 5(b))：重组里氏木霉在经氨水预处理过的秸秆基质中可以迅速生长并分泌出纤维素酶、木聚糖酶和漆酶，其中CMC酶、漆酶和木聚糖酶活力在第10 d达到峰值，分别为1313.15、8.11和5504.10 IU·g^-1。滤纸酶活力前期快速增长，第8 d开始增长变缓并趋于平稳，最终滤纸酶活力为132.26 IU·g^-1。

3.3 秸秆原料中纤维素、半纤维素和木质素的降解情况

利用重组里氏木霉降解氨水预处理后的秸秆对其降解进程进行深入研究(图 6)，发现重组里氏木霉对秸秆纤维素的降解率很高，接种后第4天秸秆纤维素的降解率就达到51.14%。接种后第10天，秸秆纤维素的降解率为77.93%，这与里氏木霉较高的纤维素酶活力有关^[25]。秸秆半纤维素的降解率低于纤维素，接种后第4天降解率达到40.26%，到第10天秸秆半纤维素的降解率为55.12%。

值得特别注意的是：重组里氏木霉对秸秆木质素也有明显的降解作用，虽然发酵前期降解率较低，但到接种后第8天，随着发酵基质中漆酶活力的明显增长，秸秆木质素的降解率也出现了明显提高。到第10天，秸秆木质素降解率可达到31.52%。重组里氏木霉对秸秆木质素的降解具有重要意义，它不但有利于促进秸秆纤维素、半纤维素的降解，加速秸秆的分解还田进程，木质素降解中间产物如乙酰丁香酮、丁香醛、香草醛、对香豆酸等还可为漆酶的催化反应提供天然介体^[26]，有利于漆酶对土壤中有机污染物的催化降解^[27-30]。

4 结论

重组里氏木霉ZJ-09在秸秆基质中固态发酵，可产生高活力的纤维素酶、漆酶和木聚糖酶，该复合酶系具有快速降解秸秆原料的协同作用。接种后第10天，秸秆总失重率可达53.45%，其中纤维素、半纤维素和木质素降解率分别为77.93%、55.12%和31.52%。本项研究工作对于进一步提升农作物秸秆快速降解还田的技术水平、促进农业生产可持续发展等具有重要意义。