2. 浙江海正药业股份有限公司，浙江 台州 318000
2. Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., Taizhou 318000, China
细胞培养是单克隆抗体(简称单抗)生产中的重要环节，这一过程直接影响到单抗的产量及质量。由于细胞培养基和细胞培养环境及培养策略直接影响细胞培养生产状况，因此为保证细胞正常生长、提高单抗产量及保证产品质量，必须监控细胞培养过程。目前，一般只对细胞培养过程的工艺参数，如pH、温度、溶氧(dissolved oxygen，DO)、搅拌速度等进行在线检测和控制，而与产品质量密切相关的生化指标仍采用取样分析方式，存在取样时间间隔较长、分析繁琐等问题，难以满足过程控制要求[1]，因此亟需开发细胞培养环节中生化指标的离线快速检测或在线检测方法。
作为细胞培养液的主要成分，水在近红外(near-infrared，NIR)光谱和中红外(mid-infrared，MIR)光谱中吸收较强[2]，培养液中其他成分的信息易被水吸收峰掩盖。而水的拉曼信号较弱[1-3]，拉曼光谱适合于水体系分析，能提供高化学特异性的分子指纹信息[4]。拉曼光谱已有报道可用于细胞培养过程中营养物[1, 4-13]、代谢产物[1, 4-7, 9, 10, 12]、细胞密度[1, 4-6, 9]、抗体表达量[14-15]等指标的检测，但利用拉曼光谱同时检测上述有关细胞生长、培养液成分和抗体表达量等三方面指标的研究未见报道。
本文以中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞培养液上清为研究对象，选择葡萄糖(glucose，Gluc)浓度、乳酸(lactate，Lac)浓度、谷氨酸(glutamate，Glu)浓度、谷氨酰胺(glutamine，Gln)浓度、活细胞密度(viable cell density，VCD)、总细胞密度(total cell density，TCD)、细胞活度(viability)和单抗表达量(Titer)等8个指标，采用偏最小二乘(partial least squares，PLS)法建立基于拉曼光谱的多指标定量校正模型，以期该方法可用于更全面地反映细胞培养过程信息，为该过程的在线检测提供了研究基础。
2 材料与方法 2.1 仪器与设备FerMac 360生物反应器(规格2 L，英国Electrolab公司)，Nova BioProfile 400多参数生化分析仪(美国Nova Biomedical公司)，Countstar IC 1000细胞计数仪(美国Inno-Alliance Biotech公司)。
i-Raman Plus便携式拉曼光谱仪(美国B & W Tek公司)，配有BAC102拉曼探头和BCR100A增强型拉曼比色皿架，以及BWRam4光谱采集软件；远紫外石英微量比色皿(外形12.5 mm × 12.5 mm × 45 mm，容积0.7 mL，宜兴晶科光学仪器有限公司)。
2.2 细胞培养本研究使用CHO细胞株，该细胞株可生产单克隆抗体。细胞培养分2组进行，每组同时进行6个批次培养过程，各组内不同批次的操作参数(pH、温度、DO)组合不同。每个批次按时间点取样4~5次，共得到样本44个。
2.3 分析方法生化指标以Nova BioProfile 400多参数生化分析仪检测，包括Gluc、Lac、Glu和Gln的浓度。以Countstar IC 1000全自动细胞计数分析仪和台盼蓝染色法测得TCD、VCD和Viability。经Protein A亲和色谱(填料MabSelect SuRe，美国GE Healthcare公司)分离后测得Titer。
2.4 拉曼光谱采集细胞培养液离心取上清，以上清少量多次润洗微量比色皿，并取上清约0.7 mL装入比色皿，置于拉曼比色皿架，采集上清的拉曼光谱。光谱采集参数为：激光波长785 nm，拉曼位移范围173.7~3 200.8 cm-1，分辨率4.5 cm-1，激光强度100% (探头端功率约为300 mW)，积分时间10 000 ms，平均次数3次，拉曼光谱扣除暗电流。共采集44份细胞培养液上清的拉曼光谱，平行采集其中36份样品的光谱3次(光谱取平均值)，采集8份样品光谱1次(样品量少仅可装样1次)。
2.5 校正模型建立采用PLS法建立细胞培养液上清的拉曼光谱与多个指标间的多元校正模型。采用SPXY (sample set partitioning based on joint X-Y distances)法[16]将样本划分为校正集和验证集，以校正误差均方根(root mean square error of calibration，RMSEC)、决定系数R2 C和验证集预测误差均方根(root mean square error of prediction，RMSEP)、决定系数R2 P评价模型的拟合能力和对未知样本的预测能力，并以此确定最优光谱预处理方法及建模所用光谱范围。数据分析由BWIQ化学计量学分析软件(Version 1.2.9，美国B & W Tek公司)。本实验的建模流程如图 1所示。
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图 1 数据获取与分析流程图 Fig.1 Flow chart of data acquiring and processing |
此外，比较模型的预测误差(以average percentage error，APE表示)与参考分析方法的误差(以相对标准偏差relative standard deviation，RSD表示)，说明模型预测性能的优劣。Nova BioProfile 400分析仪的检测误差(RSD)根据已有研究资料[1, 4]获得，细胞计数的误差则根据经验估计。APE按如下公式进行计算：
| $ APE=\frac{\sum\nolimits_{i=1}^{n}{\left| {{{\hat{y}}}_{i}}-{{y}_{i}} \right|}}{n\cdot \bar{y}} $ |
式中，
采集得到所有样本的拉曼光谱如图 2所示。由图可知，细胞培养液上清的拉曼光谱存在较明显的基线漂移现象。基线漂移可能由荧光背景变化所致，而荧光背景的增加可能与细胞代谢物的持续累积有关。根据已有文献资料[5]，有机键的响应约在500~1 700 cm-1，C—H伸缩信号约在2 800~ 3 000 cm-1。细胞培养液上清的成分复杂，待分析物的光谱信息可能相互重叠或被其他物质掩盖，光谱采集过程中存在因仪器或环境而引入的噪声，且细胞培养液上清拉曼光谱中存在基线漂移、荧光背景干扰的问题，因此需要使用光谱预处理方法，提取有用信息，去除仪器噪声，减少固有荧光[6]干扰。参考已有研究[1, 4-16, 14]，本研究使用Savitsky Golay一阶导数(SG 1st Differential)、标准正则变换(standard normal variate，SNV)和均值中心化(center)等3种方法组合作为光谱预处理方法。
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图 2 CHO细胞培养液上清拉曼光谱图 Fig.2 Raman spectra of CHO cell culture supernatants (a) raw spectra; (b) spectra preprocessed with SG 1st differential only (polynomial order 2, SG window size 15); (c) spectra preprocessed with SG 1st Differential (polynomial order 2, SG window size 15), SNV and Center |
使用SPXY法划分样本，校正集样本数与验证集样本数之比为7:3，样本划分结果见表 1。由于Lac浓度、Glu浓度、Gln浓度和Titer等指标部分参考值缺失，各指标建模数据集的样本数不尽相同。经优化，建模所用光谱预处理方法及光谱范围见表 2。
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表 1 各指标 PLS 模型的样本划分结果 Table 1 Summary of PLS model sampling |
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表 2 各指标PLS模型光谱预处理方法及光谱范围选择 Table 2 Spectral preprocessing and region selection for PLS modeling |
最终建立拉曼光谱与Gluc浓度、Lac浓度、Glu浓度、Gln浓度、VCD、TCD、Viability和Titer的定量校正模型。模型性能参数见表 3，图 3为模型预测值与参考值的相关图。
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图 3 预测值(PLS模型输出)与参考值(实测值)的相关图
Fig.3 Plots of predicted values outputted by PLS models against measured reference values
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表 3 各指标模型的性能参数 Table 3 Performance parameters of different calibration models |
表 3中APE代表了PLS模型的平均预测误差，而RSD则代表参考方法的分析误差。各模型均具有较为合理的主成分数、较高的R2、较低的RMSEC和RMSEP，且RMSEC与RMSEP相差不大，表明模型具有较好的拟合效果及预测性能。Gluc浓度模型的预测误差4.3%，略大于参考方法RSD 4%。Lac浓度、Glu浓度、Gln浓度、VCD和TCD模型的预测误差均小于参考方法误差。因此，在细胞培养过程中取样，采集培养液上清的拉曼光谱，调用模型得到各指标的预测值，即达到离线快速分析各指标的目的，用于培养过程监测。
研究表明，拉曼光谱可分辨活细胞和死细胞[17]。虽然本研究中用于拉曼光谱检测的样品均为细胞培养液上清，即样品中不含活细胞或死细胞，但实验结果表明，基于拉曼光谱的定量校正模型能较好地预测VCD和TCD指标。原因可能为活细胞或死细胞产生相关化学物质，采得的拉曼光谱包含了这些物质信息，经模型校正，与VCD和TCD关联；或者，细胞密度可能与代谢物具有相关性，通过对代谢物的定量分析，细胞密度信息间接获得。
4 结论本研究建立了基于拉曼光谱技术的CHO细胞培养液中Gluc浓度、Lac浓度、Glu浓度、Gln浓度、VCD、TCD、Viability和Titer等8项指标的快速分析方法。结果表明，该方法可用于CHO细胞培养过程样本多指标离线快速分析，从而帮助生产人员及时掌握细胞生长、培养液成分变化及单抗表达量等信息，实现细胞培养过程监测。后续研究中可通过优化拉曼光谱采集参数[9]、增加校正集代表性样本数量、更改建模算法等手段，进一步提高模型的预测性能。同时，该方法也为CHO细胞培养过程关键质控指标在线实时监测提供了研究基础，可望有助于单抗生产全程质量控制水平和产品质量的提高。
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