2. 浙江大学衢州研究院，浙江 衢州 324000
2. Institute of Zhejiang University-Quzhou, Quzhou 324000, China
美托洛尔((±)-1-异丙氨基-3-[对-(2-甲氧乙基)苯氧基]-2-丙醇，图 1)，是一种常用的β1受体阻断剂。在临床上被广泛用于治疗心血管疾病，如高血压、心律失常和心力衰竭，并可预防心肌梗死的复发[1]。美托洛尔有一个手性中心，它的两种对映体在人体内表现出不同的药理学反应，从而产生不同的药理作用。研究表明S-美托洛尔与肾上腺素的亲和力远大于R-美托洛尔，其对离体心脏的抑制效应是R-美托洛尔的33倍，而R-美托洛尔具有较强的改变眼内压效应[2-3]，能导致头晕和幻觉等副作用[4]。因此获得单一构型的S-美托洛尔，对提高药物的安全性和有效性都有着十分重要的意义。
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图 1 R-美托洛尔和S-美托洛尔的结构图 Fig.1 Chemical structures of R-metoprolol and S-metoprolol |
目前主要通过不对称合成法和外消旋体拆分法来获得光学纯的手性药物。不对称合成法的工艺路线开发难度较大，工艺路线通常也比较复杂[5]。外消旋拆分工艺路线简单，依靠手性识别剂的手性选择作用实现对手性对映体药物的分离[6]。在目前已有的报道中，主要采用手性色谱法[7-11]和手性萃取法[12-14]获取S-美托洛尔。手性色谱法的分离效果好，但是能处理的样品量很少，难以实现工业化，因此主要用于分析或获得少量纯异构体。手性萃取法具有操作简单、成本低和易于工业化生产的优点，是一种最有发展潜力和应用前景的单一对映体制备技术[15-16]。ZHANG等[12, 14]对美托洛尔进行反应萃取拆分研究，并设计了多级连续萃取工艺，在硼酸和环己基-D-酒石酸酯进行的协同识别作用下，该体系表现出良好的对映体选择性，经过20级萃取后，产物收率可达64.68%，ee值为98.64%。但该过程的低温环境需耗费大量能量，硼酸的引入增加了体系复杂性，此外环己基-D-酒石酸酯的合成需要大量对环境有害的甲苯[17]。因此，寻找绿色高效的手性识别剂仍是研究重点之一[15, 18]。
氨基酸离子液体(AAIL)是一种手性离子液体，具有成本低、热稳定好、蒸气压低和生物可降解等优点[19]。此外，氨基酸离子液体具有的结构可调性可以扩大手性识别剂的选择范围，满足不同体系的分离要求[20-21]。目前，已有少量的氨基酸离子液体应用于手性萃取拆分，并且表现出很好的拆分效果[22]。练伟平等[23]采用氨基酸离子液体作为手性选择剂对酮洛芬对映体进行了手性萃取拆分。DING等[24]采用氨基酸离子液体对氨氯地平对映体进行手性液液萃取拆分，并且通过量子化学计算预测手性识别剂，指导了手性离子液体的选取。
本文以氨基酸离子液体为手性识别剂，采用手性液液萃取拆分法对美托洛尔对映体进行手性拆分。研究氨基酸离子液体种类和浓度，有机溶剂，美托洛尔初始浓度，水相pH以及温度等因素对手性萃取分配行为的影响。以期为氨基酸离子液体在手性拆分中的应用和手性液液萃取拆分法的工业化提供参考。
2 实验部分 2.1 实验设备与试剂LSHZ-300水浴恒温振荡器(太仓市豪城实验仪器制造有限公司)；Agilent 1260 Infinity Ⅱ型液相色谱仪(安捷伦有限公司)。
美托洛尔消旋体(分析纯，98.0%，TRC有限公司)；R-美托洛尔(标准品，98.0%，TLC制药标准有限公司)；异丙醇(色谱纯，99.8%，国药集团化学试剂有限公司)；二乙胺(色谱纯，99.5%，上海阿拉丁有限公司)；正己烷(色谱纯，95%，Sigma-Aldrich化学有限公司)；1-丁基-3-甲基咪唑L-色氨酸([Bmim][L-Trp])、1-丁基-3-甲基咪唑L-组氨酸([Bmim][L-His])、1-丁基-3-甲基咪唑L-谷氨酸([Bmim][L-Glu])、1-丁基-3-甲基咪唑L-苯丙氨酸([Bmim][L-Phe])、1-丁基-3-甲基咪唑L-丝氨酸([Bmim][L-Ser])均为分析纯，购自上海成捷化学有限公司；正辛醇等其他试剂均为分析纯，分别购自上海阿拉丁有限公司和国药集团化学试剂有限公司。
2.2 萃取实验过程将氨基酸离子液体溶解于0.2 mol·L-1的磷酸盐缓冲溶液中作为水相，将美托洛尔消旋体溶解于有机相。各取3 mL的水相和有机相于10 mL的离心管中，在一定温度下水浴振荡至相平衡，然后静置半小时。手性液液萃取完成后，通过高效液相色谱法分析油相中R-美托洛尔和S-美托洛尔的浓度。水相中的对映体浓度根据质量守恒求得。
2.3 分析方法通过高效液相色谱测定有机相中R-美托洛尔和S-美托洛尔的浓度。手性色谱柱为CHIRALPAK ID (5 μm，4.6 mm × 250 mm)，柱温保持在30 ℃，流动相中正己烷/异丙醇/二乙胺的比例为80/20/0.01，检测器为紫外可见吸收检测器，检测波长为228 nm，进样注射量为5 μL，流量为1 mL·min-1。R-美托洛尔和S-美托洛的保留时间通过R-美托洛尔标准品验证，其中R-美托洛尔先于S-美托洛尔出峰。
S-美托洛尔和R-美托洛尔的分配系数及对映体选择性系数由以下各式求得：
| $ {K_{\rm{S}}} = \frac{{{C_{{\rm{So}}}}}}{{{C_{{\rm{Sa}}}}}} $ | (1) |
| $ {K_{\rm{R}}} = \frac{{{C_{{\rm{Ro}}}}}}{{{C_{{\rm{Ra}}}}}} $ | (2) |
| $ \alpha = \frac{{{K_{\rm{S}}}}}{{{K_{\rm{R}}}}} $ | (3) |
其中CSo和CSa分别表示有机相和水相中S-美托洛尔的浓度，CRo和CRa分别表示有机相和水相中R-美托洛尔的浓度，α为美托洛尔对映体的选择性系数，KS和KR分别表示S-美托洛尔和R-美托洛尔的分配系数。
3 实验结果与讨论 3.1 氨基酸离子液体的筛选探究5种氨基酸离子液体对美托洛尔对映体萃取拆分过程的影响。5种氨基酸离子液体分别为[Bmim][L-Trp]、[Bmim][L-His]、[Bmim][L-Glu]、[Bmim][L-Phe]和[Bmim][L-Ser]。结果如表 1所示。由结果可知，在所选氨基酸离子液体中，[Bmim][L-Phe]的对映体选择性为1.02，基本不具备手性识别作用。[Bmim][L-Glu]、[Bmim][L-Ser]和[Bmim][L-His]具备较低的对映体选择性，分别为1.09、1.12和1.15。而[Bmim] [L-Trp]表现出较高的对映体选择性，其选择性为1.29。对映体识别作用主要是由于两种对映体与氨基酸离子液体存在弱相互作用差异，如氢键、π-π堆积、空间位阻差异。在实验的五种氨基酸离子液体中，[Bmim][L-Trp]的选择性系数最高，说明其与R-美托洛尔和S-美托洛尔之间的弱相互作用差异最大，从而表现出较好的对映体选择识别作用。因此选择[Bmim] [L-Trp]作为手性识别剂。
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表 1 氨基酸离子液体种类对分配系数和对映体选择性的影响 Table 1 Effects of amino acid ionic liquids on distribution coefficients and enantioselectivity |
研究美托洛尔对映体在不同有机溶剂中的萃取分配行为。结果如表 2所示。当使用1, 2-二氯乙烷作为溶剂时，美托洛尔对映体的对映选择性最高达到1.29。当二氯甲烷用作有机溶剂时，美托洛尔的对映选择性为1.17，但两种对映体的分配系数过大，分别达到47.11和55.20，美托洛尔几乎全部溶解在油相中，导致单级处理量过少。而单级处理量过少会使得溶剂用量明显增加，同时也增加了工业操作难度，不利于对映体的手性萃取分离过程[25]。当选用正辛醇和正癸醇用作溶剂时，其选择性分别为1.18和1.20，低于采用1, 2-二氯乙烷时的对映体选择性。因此与实验采用的其他疏水性有机溶剂相比，1, 2-二氯乙烷是一种合适的有机溶剂。
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表 2 有机溶剂对分配系数和对映体选择性的影响 Table 2 Effects of organic solvents on distribution coefficients and enantioselectivity |
美托洛尔手性液液萃取拆分过程依靠手性识别剂[Bmim][L-Trp]的识别作用，涉及手性识别剂与美托洛尔对映体之间的多种分子间作用力，因此[Bmim][L-Trp]浓度对分离效果产生影响。为了研究不同[Bmim][L-Trp]浓度对萃取拆分效果的影响，制备了浓度为0.01~0.05 mol·L-1，pH为8.5的[Bmim][L-Trp]溶液，并分别将其用于萃取体系中，结果如图所示。从图 2可以看出，两种美托洛尔对映体的分配系数随着[Bmim][L-Trp]浓度的增加而降低。这说明[Bmim][L-Trp]浓度越高，美托洛尔对映体与[Bmim][L-Trp]之间的相互作用越强，从而使得更多的美托洛尔留在水相。对映体选择性随[Bmim][L-Trp]浓度变化较大，表现出先上升后下降的趋势，在离子液体浓度为0.03 mol·L-1时达到最大值。这是由于过多的离子液体加强了其与美托洛尔之间的非选择性识别作用，弱化了手性识别作用，导致对映体选择性下降。因而合适的手性识别剂浓度为0.03 mol·L-1。
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图 2 [Bmim][L-Trp]浓度对分配系数和对映选择性的影响 Fig.2 Effects of [Bmim][L-Trp] concentration on distribution coefficients and enantioselectivity c (metoprolol) = 2 mmol·L-1, pH = 8.5, T = 25 ℃, dichloroethane as an organic solvent |
温度是手性液液萃取过程的重要影响因素之一，研究温度对手性液液萃取过程的分配系数和对映体选择性的影响，结果如图 3所示。两种对映体的分配系数随温度的升高而增大。当温度小于25 ℃时，对映体选择性由于分配系数的增大而增大；当温度大于25 ℃时，温度继续升高降低了手性识别剂与药物对映体之间的手性选择作用[26]，此时由于温度升高造成手性识别作用下降的效果强于分配系数升高带来的对映体选择性上升的效应，故而对映体选择性表现为随着温度的升高而降低。因此，选择室温25 ℃作为该体系的萃取温度。
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图 3 温度对分配系数和对映选择性的影响 Fig.3 Effects of temperature on distribution coefficients and enantioselectivity c (metoprolol) = 2 mmol·L-1, c ([Bmim][L-Trp]) = 0.03 mol·L-1, pH = 8.5, dichloroethane as an organic solvent |
美托洛尔对映体的初始浓度会影响其与手性识别剂[Bmim][L-Trp]形成的非对映体复合物浓度，进而对萃取分离效果产生影响。图 4显示了浓度范围为1~5 mmol·L-1的美托洛尔初始浓度对分配系数和对映选择性的影响结果。从结果可知，在实验体系下，R-美托洛尔和S-美托洛尔的分配系数随浓度增大而缓慢增大；而对映体选择性随着美托洛尔初始浓度的增大而下降。说明低浓度的美托洛尔对映体有利于手性识别过程。当药物浓度低于2 mmol·L-1时，对映体选择性变化不明显，在对映体浓度分别为1和2 mmol·L-1时，对映体选择性分别为1.30和1.29。当药物浓度高于2 mmol·L-1时，对映体选择性下降较快，这可能是因为过高的美托洛尔对映体浓度导致一部分美托洛尔对映体未经过手性识别作用直接进入油相，导致选择性系数下降。考虑到高浓度意味着处理量大，更有利于实际工业生产，因此，药物初始浓度选为2 mmol·L-1。
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图 4 美托洛尔浓度对分配系数和对映选择性的影响 Fig.4 Effects of metoprolol concentration on distribution coefficients and enantioselectivity c ([Bmim][L-Trp]) = 0.03 mol·L-1, pH = 8.5, T = 25, ℃ dichloroethane as an organic solvent |
水相pH也是手性液液萃取过程中的重要影响因素之一。探究不同pH的萃取体系下美托洛尔对映体的分配系数和对映选择性，结果如下图所示。从图 5中可以看出，S-美托洛尔和R-美托洛尔的分配系数随着pH的增大而增大。由于美托洛尔是一种弱碱性药物，当水相pH较低时，水相中美托洛尔离子增多，美托洛尔在水中的溶解度增大，美托洛尔的分配系数降低。而美托洛尔对映体选择性随着pH的增加表现出上升的趋势。当pH为8.5时，美托洛尔对映体选择性为1.29；当pH为9.0时，美托洛尔对映体选择性为1.42，但此时R-美托洛尔和S-美托洛尔在萃取体系的分配系数分别为11.16和15.86，此时分配系数过大，两种对映体药物大部分都溶于油相中，使得水相处理量大大增加，不利于实际生产过程。因此，综合考虑对映体选择性和分配系数的因素，本文选择8.5作为实验pH。
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图 5 pH对分配系数和对映选择性的影响
Fig.5 Effects of pH on distribution coefficients and enantioselectivity
c ([Bmim][L-Trp]) = 30 mmol·L-1,
c (metoprolol) = 2 mmol·L-1, T = 25 ℃, dichloroethane as an organic solvent |
本文采用低成本、可降解的氨基酸离子液体作为手性识别剂，用于美托洛尔对映体的液液萃取拆分过程。通过不同双相萃取实验筛选出[Bmim] [L-Trp]作为美托洛尔手性液液萃取体系的手性识别剂，并对以上影响因素进行优化分析。研究发现较合适的手性萃取温度为室温，所需的氨基酸离子液体浓度较低。这有利于降低手性液液萃取过程中的能耗和生产成本，有助于推动氨基酸离子液体用于手性拆分过程和手性液液萃取拆分的工业化应用。
4 结论(1) 实验所选的4种氨基酸离子包括[Bmim][L-Trp]、[Bmim][L-Glu]、[Bmim][L-Ser]和[Bmim][L-His]均有手性识别作用，其中[Bmim][L-Trp]的手性识别选择作用效果最好。
(2) 有机溶剂，[Bmim][L-Trp]浓度，美托洛尔初始浓度，pH值和温度均会对手性萃取拆分效果产生影响。当[Bmim] [L-Trp]浓度为30 mmol·L-1，美托洛尔的初始浓度为2 mmol·L-1，水相pH值为8.5，温度为25 ℃时，分离效果最佳，其中R-美托洛尔和S-美托洛尔的分配系数分别为4.71和6.06，对映体选择性达到1.29。
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