含酚废水的污染已经成为全球性的问题，然而，传统方法对含酚废水的处理效果差，去除率低[1]。漆酶是一种多铜氧化酶，具有很强的氧化还原能力[2]，能催化氧化酚类化合物、多环芳烃、多氯联苯等难降解有机污染物，为水体中有机污染物的治理和修复提供了一种有效途径。与其它方法相比，漆酶催化氧化法能耗低、易操作、降解效率高、使用范围宽，是一项前景广阔的生物处理技术[3~5]。
纯漆酶生产成本高、易溶于水、难以回收且不稳定，在实际应用中有一定的局限性。通过对漆酶固定化，可以提高其重复利用率、稳定性并降低酶催化成本。漆酶固定化的关键在于所选择的载体，它对漆酶的活性和对环境的耐受性等方面有着决定性的作用。近年来国内外学者对漆酶的固定化进行了较为广泛的研究，常用载体主要有纳米材料、介孔材料、壳聚糖、硅胶、亲水性微滤膜等[6~9]。纳米材料和介孔材料具有比表面积大、酶的固载量高等优点，但纳米材料不易从反应体系中分离和回收[8]，而介孔材料在酶的固定化及固定化酶催化底物反应过程中常存在传质阻力，甚至孔径较小时酶只能固定在载体表面[9]。相对于介孔材料，大孔材料由于具有较大的孔径从而减小了酶固定过程中的传质阻力，而且大孔材料更易于引入功能化基团[10]。Li等[11]研究聚苯乙烯微球孔径大小对脂肪酶固定的影响时发现，当载体的孔径远远大于脂肪酶分子尺寸时，固定化脂肪酶表现出更高的活性。
壳聚糖分子中含有大量的氨基和羟基，具有较强的吸附络合能力、生物相容性好，且易于成膜、无毒无害，但作为酶的固定化载体单独使用时存在吸附容量小、吸湿性强、机械性能差等缺点[12~14]。Kalkan[15]等研究表明由壳聚糖和无机材料组成的复合材料是一种良好的载体，可改善壳聚糖单独作载体的不足，并很好地保持酶的活性。
本课题组在前期工作中制备了一种由SiO2纳米薄膜构筑的新型大孔材料，该大孔材料具有三维连续贯通的孔道、比表面积可达130 m2·g-1、孔隙率93%[16, 17]。本文通过在SiO2大孔材料孔壁表面吸附壳聚糖并用戊二醛交联，制备了二氧化硅/壳聚糖(SiO2/CS)复合大孔材料，以SiO2/CS为载体，系统研究漆酶固定化的条件，对比游离漆酶和固定化漆酶的相关性质；并研究固定化漆酶对2, 4-DCP的催化降解作用，考察降解时间、pH值、温度、2, 4-DCP的初始浓度对降解效果的影响。
2 实验材料和方法 2.1 试剂诺维信单丽来漆酶(活性约为40 U·g-1)，工业级，广州市海诺生物工程有限公司；壳聚糖，AR，脱乙酰度为95%，上海阿拉丁试剂有限公司；2, 2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，BS，西安热默尔生物科技有限公司；2, 4-二氯苯酚，AR，上海阿拉丁试剂有限公司；戊二醛和4-氨基安替比林，AR，国药集团化学试剂有限公司；铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])，AR，天津博迪化工股份有限公司。
2.2 仪器傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)，PEOTEGE460 E.S.P型，美国Nicolet公司；扫描电镜(SEM)，SU70型，美国AMETEK公司；能谱仪(EDX)，EDAX型，美国AMETEK公司；紫外可见分光光度计，T6新世纪型，北京普析通用。
2.3 SiO2/CS的制备以具有三维骨架结构的环氧树脂大孔聚合物为整体型模板，利用硅酸酯原位水解和高温烧结制备尺寸为0.3~0.4 cm的块状SiO2大孔材料[17]。
用2%的乙酸溶液配制质量浓度为1%的壳聚糖溶液。称取1 g块状SiO2大孔材料于80℃下干燥2 h，置于含壳聚糖溶液的磨口锥形瓶中，在25℃、转速为50 r·min-1的摇床中振荡6 h、滤出，将大孔材料在50℃真空干燥2 h。将上述干燥后的大孔材料浸入戊二醛质量浓度为0.1%的溶液中振荡反应6 h，滤出大孔材料、用蒸馏水反复冲洗、真空干燥，即得二氧化硅/壳聚糖块体大孔复合材料(SiO2/CS)。壳聚糖的吸附量用称重法确定。
2.4 漆酶的固定化取0.1 g SiO2/CS置于10 mL用PBS缓冲溶液配置的漆酶溶液中，在25℃、转速为50 r·min-1的摇床中振荡一定时间，将大孔材料滤出后，用缓冲溶液洗涤至上清液中检测不到酶活。
2.5 酶活的测定用分光光度法，以ABTS为底物测定漆酶的活性。定义每分钟使1 µmol的ABTS氧化所需的酶量为一个酶活单位。游离漆酶酶活的测定：取定量稀释后的酶液和1.0 mmol·L-1 ABTS进行等体积反应，所用介质均为适当pH值的缓冲溶液。测定反应体系3 min内在420 nm处的吸光度变化。固定化漆酶酶活的测定：取0.1 g固定化漆酶，加2 mL相应pH值的缓冲液和1 mL浓度为1.0 mmol·L-1 ABTS溶液，反应3 min，测上清液在420 nm处的吸光度变化。比酶活用每克固定化漆酶的酶活(U·g-1)表示。为便于考察变量对酶固定化条件以及固定化酶性质的影响，以同组实验中酶活最高值或处理前的酶活性为100%进行数据处理。根据固定化酶与固定化前总游离酶的活性比计算固定化酶的活性回收率。
2.6 固定化漆酶对2, 4-DCP的降解称取0.1 g固定化漆酶置于50 mL用PBS缓冲溶液配制的2, 4-DCP溶液中，在一定温度下，转速为50 r·min-1的摇床中反应一定时间，将固定化漆酶滤出后，检测2, 4-DCP的浓度，计算去除率。用0.1 g经灭活后的固定化漆酶在相同条件下重复上述实验，测定2, 4-DCP的浓度，计算载体对2, 4-DCP的吸附率。
2.6.1 去除率、吸附率和降解率的计算2, 4-DCP的去除率、吸附率及降解率的计算公式如下：
| $ 去除率 = \frac{{{C_0} - {C_1}}}{{{C_0}}} \times 100\% $ | (1) |
| $ 吸附率 = \frac{{{C_0} - {C_2}}}{{{C_0}}} \times 100\% $ | (2) |
| $ 降解率 = 去除率 - 吸附率 $ | (3) |
式中，C0为2, 4-DCP的初始浓度，C1为固定化漆酶去除2, 4-DCP后的剩余浓度，C2为载体吸附2, 4-DCP后剩余的浓度。
2.6.2 2, 4-DCP浓度的测定采用分光光度法对2, 4-DCP的浓度进行测定。在pH=10±0.2的反应体系中，酚类化合物在铁氰化钾存在的情况下与4-氨基安替比林反应生成橙红色的吲哚酚安替比林染料，该染料的水溶液在510 nm处有最大吸收波长。
固定化漆酶降解2, 4-DCP一定时间后，将固定化漆酶滤出，用0.5 mol·L-1的NH3·H2O溶液将2, 4-DCP溶液的pH调节至10±0.2，然后依次加入1 mL 80 g·L-1的铁氰化钾溶液和1 mL 2%的4-氨基安替比林溶液，混合均匀后反应15 min，以蒸馏水作为参比液，紫外-可见分光光度计测定510 nm处的吸光度值。扣除空白值，计算2, 4-DCP的去除率。
3 结果和讨论 3.1 SiO2/CS复合大孔材料的表征 3.1.1 扫描电镜图 1为SiO2大孔材料(a)和SiO2/CS复合大孔材料(b)的扫描电镜图。从图中可以看出SiO2大孔材料具有三维连续的超薄膜结构，在孔径为300~500 nm和1~2 μm有两套连续贯通的孔道。对比图 1(a)和图 1(b)，可以发现负载壳聚糖的大孔复合材料，孔道仍然相互贯通，保持了原有的骨架结构，不存在壳聚糖堵塞孔道现象。
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图 1 SiO2大孔材料(a)和SiO2/CS复合材料(b)的SEM图 Fig.1 SEM images of SiO2 macroporous materials (a) and SiO2/CS composites (b) |
EDX分析SiO2和SiO2/CS复合大孔材料所含元素的结果如图 2。由图 2a可知，对于SiO2大孔材料，只检测到O和Si元素的存在。图 2b和2c是随机检测SiO2/CS表面和内部的元素谱图，均检测到C和N元素的存在，从图中可以看出，SiO2/CS表面和内部的C、N元素含量百分比相近。通过称重法测得SiO2大孔材料吸附壳聚糖后质量增加约为5%，结合扫描电镜分析可知，壳聚糖均匀地负载在SiO2大孔材料的孔壁上。
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图 2 SiO2和SiO2/CS复合材料的EDX谱图 Fig.2 EDX spectra of SiO2 and SiO2/CS composites |
图 3为SiO2大孔材料负载壳聚糖前后的红外光谱。图 3(a)中3446 cm-1出现的宽峰为大孔SiO2表面硅羟基的吸收峰，1639 cm-1处出现的微弱的峰为大孔SiO2的自由吸附水H-O-H弯曲伸缩振动峰，1090 cm-1处为Si-O-Si的反对称伸缩振动，804和466 cm-1处为Si-O的对称伸缩振动。负载壳聚糖后(图 3(b))，3446 cm-1处出现的峰变强，这是SiO2大孔材料表面硅羟基的伸缩振动吸收峰与壳聚糖的-NH2的叠加效果；2920 cm-1出现较弱的峰为亚甲基的吸收峰；壳聚糖酰胺Ⅰ带吸收峰和SiO2上硅羟基的弯曲振动吸收峰重合，导致1639 cm-1出的吸收峰变强。分析表明，壳聚糖已成功引入到SiO2大孔材料中，形成了SiO2/CS复合材料。
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图 3 SiO2(a)和SiO2/CS(b)的红外光谱图 Fig.3 IR spectra of SiO2 (a) and SiO2/CS (b) |
固定化酶的酶活随固定化时间的变化曲线如图 4所示，随着漆酶在SiO2/CS载体上固定化时间的增加，相对酶活先呈上升趋势，当固定化时间达到4 h时，相对酶活达到最大，继续延长固定化时间酶活不再升高，反而略有下降，可能是酶在该固定化环境中随着时间的延长失活比例增高[18]，所以固定化时间增加，酶活却不增加。
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图 4 时间对固定化漆酶的影响 Fig.4 Effects of time on laccase immobilization |
固定化过程中，溶液的pH值影响着载体和漆酶的离子化状态，从而影响着载体与酶的结合程度，造成固定化酶活力的差别。这是因为载体与漆酶之间具有一定的静电作用，溶液的酸碱性影响载体带电基团的电性，也对漆酶所带电荷有一定影响。同时酶作为一种蛋白质，当溶液的pH值超过一定范围时，微观结构会发生变化，引起酶的失活。从图 5可见，固定漆酶的最佳pH值为4.5，制得的固定化酶的活力最大。
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图 5 pH对漆酶固定化的影响 Fig.5 Effects of pH on laccase immobilization |
漆酶初始浓度对固定化酶活性的影响如图 6所示，随着酶液浓度的增大，活性先逐渐增加；当酶初始浓度为40 mg·mL-1时，固定化酶达到最大活力136.8 U·g-1；但酶浓度超过40 mg·mL-1后，酶活性开始降低。酶液浓度增大，载体结合酶蛋白的总量增加，比活力增加，但酶的结合量继续增大时，造成酶分子拥挤，并非每个酶分子都有机会与底物结合，整体表现为固定化酶活性呈下降趋势，这与用纳米SiO2改性壳聚糖载体固定化酶的情况类似[19]。当固定化酶达到最大酶活力时，酶活回收率为85.5%，高于一些用纯漆酶制备的固定化酶的酶活回收率[20]。
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图 6 漆酶初始浓度对固定化的影响 Fig.6 Effects of initial concentration of laccase on the immobilization |
在不同pH的PBS缓冲溶液中保存2 h后测定游离漆酶和固定化漆酶的酶活，结果如图 7所示，漆酶在偏酸性的条件下放置较稳定，随着pH值的升高，酶的活性受到了极大的抑制，而固定化后漆酶的相对活性远高于游离酶。由于固定化酶载体孔道内部的微环境与外部环境存在一定的差异，对孔道内的pH起到了缓冲作用，与游离酶相比，固定化酶的pH稳定性要高。
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图 7 游离漆酶和固定化漆酶的pH稳定性 Fig.7 pH stability of free and immobilized laccase |
将固定化漆酶和游离漆酶置于不同温度下保温2 h测定它们的酶活，如图 8所示，固定化漆酶的热稳定性远远优于游离漆酶的热稳定性。在20~60℃，固定化漆酶表现出较高的相对酶活。这说明漆酶通过吸附作用固定在SiO2/CS复合材料上，漆酶分子结构刚性增强，构象发生变化不易被破坏，导致游离漆酶和固定化漆酶对温度的敏感性不一样。
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图 8 游离漆酶和固定化漆酶的热稳定性 Fig.8 Thermal stability of free and immobilized laccase |
固定化漆酶与ABTS在室温下连续反应10批次的结果如图 9所示。经过7批次反应后，固定化漆酶活性变化较小，循环操作10批次后，固定化漆酶的剩余酶活还能保持在68.4%，说明漆酶经固定化具有良好的操作稳定性，优于漆酶固定在聚超细纤维上(10批次后剩余酶活为50%)[21]。
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图 9 固定化漆酶的操作稳定性 Fig.9 Operational stability of immobilized laccase |
米氏常数Km是酶的特征性常数，其值等于酶促反应的速度达到最大反应速度一半时酶的浓度，只与酶的性质、酶促反应的底物以及反应条件有关，是衡量底物与酶之间亲和力大小的依据[22]。配置浓度c为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1的ABTS溶液，0.1 g固定化漆酶和1 mL游离漆酶在PBS缓冲体系中分别与ABTS反应5 min，测定420 nm处吸光度变化值，计算酶促反应的初速度ν，由Lineweaver−Burk双倒数法处理得图 10。通过计算求得游离漆酶的Km为0.370 mmol·L-1，固定化漆酶的Km值为0.699 mmol·L-1。漆酶固定化后米氏常数变大，表明漆酶与底物间的亲和力降低，这是因为漆酶被固定化后，空间位阻增大，底物与漆酶活性中心的接触几率变小[23]。
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图 10 漆酶的Lineweaver-Burk双倒数图 Fig.10 Lineweaver-Burk plots of free and immobilized laccase |
分别将0.1 g固定化漆酶置于50 mL不同pH值、初始浓度为20 mg·L-1的2, 4-DCP溶液中，在30℃下反应6 h。pH对2, 4-DCP去除效率如图 11所示，固定化漆酶对2, 4-DCP的去除率随pH的增加呈先上升后下降的趋势，在pH为3时，去除率达到最大，为63.1%，此时，降解率为45.5%。对比固定化漆酶的酶学性质，底物为ABTS时固定化漆酶的最适合pH值也为3。
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图 11 pH值对固定化漆酶去除2, 4-DCP的影响 Fig.11 Effects of pH on 2, 4-DCP removal by immobilized laccase |
固定化漆酶对2, 4-DCP的去除率、降解率以及载体对2, 4-DCP的吸附率随时间的变化如图 12所示。由图可知，在0~8 h，固定化漆酶对2, 4-DCP的去除率线性上升，溶液中2, 4-DCP浓度迅速降低，8~10 h，降解速率减缓，这是由于在固定化漆酶对2, 4-DCP降解的过程中，底物浓度减少导致降解速率减缓，降解产物的积累也会使2, 4-DCP的氧化受到抑制[24]。反应8 h后，固定化漆酶对2, 4-DCP的降解率达61.5%，此时去除率为80.3%，其中吸附率为18.8%。
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图 12 时间对固定化漆酶去除2, 4-DCP的影响 Fig.12 Effects of time on 2, 4-DCP removal by immobilized laccase |
如图 13所示，固定化漆酶对2, 4-DCP的去除率和载体对2, 4-DCP的吸附率均随浓度的增大而减小，可能是随着底物浓度的增大，固定化漆酶催化氧化2, 4-DCP时，生成的中间产物逐渐增多并造成累积[25]，固定化漆酶部分失活，降解率下降；还可能是2, 4-DCP浓度的增大，会对固定化酶产生较大的毒性使部分漆酶失活[26, 27]。由图可知，固定化漆酶去除初始浓度为50 mg·L-1 2, 4-DCP，降解率为26.5%，此时，去除率和吸附率分别为33.1%和6.6%。
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图 13 初始浓度对固定化漆酶降解2, 4-DCP的影响 Fig.13 Effects of initial concentration on 2, 4-DCP removal by immobilized laccase |
温度对固定化漆酶去除2, 4-DCP(50 mL、20 mg·L-1)的影响如图 14所示，在30~50℃，固定化漆酶对2, 4-DCP的去除率呈上升趋势。在温度为50℃时，去除率和降解率达到最大值，分别为83.2%和65.6%。由图 14可知，固定化漆酶对2, 4-DCP催化氧化反应可以在较宽的温度范围内进行，这是因为漆酶被固定化之后，空间结构发生变化，温度的变化对固定化漆酶影响变弱[28]。尽管高温会使漆酶活性变高，但是长时间在高温下，会导致酶蛋白变性失活，因此固定化漆酶去除2, 4-DCP的最佳温度为50℃。
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图 14 温度对固定化漆酶降解2, 4-DCP的影响 Fig.14 Effects of temperature on 2, 4-DCP removal by immobilized laccase |
称取0.1 g固定化漆酶，置于50 mL、pH为3的20 mg·L-1的2, 4-DCP溶液中，在转速为50 r·min-1的摇床上，30℃下反应8 h后，滤出固定化漆酶，测定溶液的吸光度。固定化漆酶用缓冲溶液多次洗涤后，重复上述操作，循环6次。如图 15所示，随着反应批次的增加，固定化漆酶对2, 4-DCP的去除率、降解率和载体对2, 4-DCP的吸附率均下降。反应6次后，去除率由79.3%降到36.8%，降解率由61.1%降到29.4%。Nelson[29]等研究发现固定化漆酶降解废水中的酚类污染物时，使用效率主要受到两方面的影响，一是反应过程中有色产物吸附在载体表面，二是漆酶催化氧化酚类化合物产生不溶物。氧化产物吸附在固定化载体表面阻止了载体和酶分子与氯酚分子的进一步接触，造成在反复使用过程中降解率和吸附率的下降。
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图 15 固定化漆酶去除2, 4-DCP的重复使用性 Fig.15 Reusability of immobilized laccase for 2, 4-DCP removal |
以具有三维超薄膜结构的块体SiO2大孔材料作为基质，通过壳聚糖在其孔壁上的吸附，制备了SiO2/CS大孔复合材料，采用物理吸附法将其用于固定化漆酶，系统研究了固定化条件，对比了固定化漆酶和游离漆酶的酶学性质，并将固定化酶应用于降解水中的2, 4-DCP。研究结果表明：漆酶固定化后，耐酸碱性和热稳定性都得到明显提高；应用块体大孔材料固定化酶克服了使用微纳米材料不易从反应体系中分离出来的缺点，同时，由于孔径大降低了传质阻力，提高了固定化酶的使用效率，使其在降解有机污染物方面有良好的应用前景。在后续工作中我们将通过合理修饰该块体SiO2大孔材料，采用共价结合法或离子亲和法进一步提高固定化漆酶的比酶活和操作稳定性。
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