2. 浙江工业大学 生物工程学院, 浙江 杭州 310014
2. College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China
秸秆是农业生产中的主要废弃物。我国的秸秆种类多、数量大，每年都有大量的秸秆资源没有得到合理有效利用，带来一系列的环境问题[1-2]。秸秆的主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，富含氮、磷、钾等元素。秸秆还田作为秸秆利用的一种重要方式，可以减少化学肥料的使用、有效增加土壤的有机质含量、改善土壤结构。但在直接还田情况下，存在秸秆降解效率低、秸秆降解周期长等问题，不利于下一茬作物的种植。
土壤污染是我国面临的主要环境问题之一。据统计，我国受有机污染物污染的农田达3 600万hm2，主要污染物包括抗生素、农药、多环芳烃等[3]。土霉素是一种兽用抗生素，作为动物饲料添加剂和药物被广泛应用于养殖业，不可避免地导致了环境污染，在我国不同区域都检测出了土霉素的残留[4-5]。毒死蜱是具有代表性的有机磷酸酯类农药，具有高效、广谱的优点，被广泛应用于农业害虫防治。毒死蜱在土壤中半衰期较长，在未灭菌土壤中1 g·kg-1的毒死蜱半衰期为278 d，而灭菌土壤中毒死蜱的半衰期是未灭菌土壤的3~4倍[6]。2, 4, 5-三氯酚(2, 4, 5-trichlorophenol，2, 4, 5-TCP) 是一种典型的氯酚类污染物，它不仅广泛应用于下游农药的生产，其本身也可以作为农药使用；它毒性强并且难以自然降解，在环境中检出率较高。上述这些有机污染物会在土壤表层积累、被植物吸收、对动物和人类的健康造成潜在的威胁[7-9]。
漆酶是一种多铜氧化酶，能够利用分子氧在自由基催化机制下氧化各种酚类和非酚类物质[10]。漆酶的底物谱广泛，并且仅利用氧气作为最终的电子受体，是一种环境友好型催化剂。此外，一些小分子能够作为介体扩展漆酶的底物谱，这使得漆酶在有机污染物治理方面具有很强的应用潜力[11]。已有研究表明，基于漆酶的生物修复技术[12-13]可以有效去除环境中的多环芳烃、抗生素、染料等污染物。现有的研究主要集中在固定化漆酶技术以及水体中污染物的去除，直接利用漆酶降解土壤中有机污染物的研究还相对匮乏。
本实验室在前期工作中构建了一株能产出高活力漆酶的重组里氏木霉菌株(trichoderma reesei ZJ-09)[14]，本研究在此基础上利用几种特定微生物构建了新型秸秆降解菌剂，将秸秆快速降解与污染土壤生物修复过程进行有机耦合，利用微生物在秸秆基质中发酵生产的酶曲实现秸秆的快速降解；同时对土壤中的有机污染物进行高效降解，从而实现土壤修复。
2 实验(材料与方法) 2.1 实验材料 2.1.1 菌种重组里氏木霉，主要产出漆酶和纤维素酶，带有来自血红密孔菌(pycnoporus sanguineus)的耐高温漆酶基因，由本实验室构建，保存在PDA斜面培养基上。
彩绒革盖菌(coriolus versicolor)，主要产出漆酶；黑曲霉(aspergillus niger ZU-06)，主要产出半纤维素酶。它们均为实验室保藏菌种[15]。
2.1.2 有机物污染土壤的预处理有机物污染土壤取自浙江杭州郊区某农田，于通风条件下自然风干，筛选剔除杂质后研碎备用。利用高效液相色谱测定不同污染土壤的有机污染物含量，其中毒死蜱污染土壤中毒死蜱含量为52.4 mg·kg-1、土霉素污染土壤中土霉素含量为73.7 mg·kg-1、2, 4, 5-三氯酚污染土壤中2, 4, 5-三氯酚含量为59.7 mg·kg-1。
2.1.3 试剂毒死蜱乳油购自江西农喜作物科学有限公司，盐酸土霉素购自上海吉至生化科技有限公司，2, 4, 5-三氯酚购自生工生物工程(上海) 股份有限公司。
2.2 培养基PDA斜面培养基：新鲜马铃薯200，葡萄糖20，琼脂粉20。
彩绒革盖菌种子培养基：葡萄糖10，酵母粉1，(NH4)2SO4 1.4，KH2PO4 2，CaCl2 0.4，尿素0.3，MgSO4·7H2O 0.2，C6H8O7·H2O 10.5，NaOH 3.9，CoCl2 0.0037，ZnSO4 0.0014，MnSO4 0.0016，FeSO4 0.005。
固态发酵营养液：(NH4)2SO4 10，尿素2，KH2PO4 2，CuSO4 0.1。
注：以上数值单位均为g·L-1。
固态发酵培养基：氨水处理后的水稻秸秆80 g·100 g-1干重，麸皮20 g·100 g-1干重，此外另加固态发酵营养液250 mL。
2.3 水稻秸秆的氨水预处理方法水稻秸秆取自浙江绍兴郊区。将水稻秸秆切成5~10 cm的小段，按照每g秸秆配10 mL氨水加入10 % (质量分数)的氨水，在25~30 ℃室温下浸泡24 h，抽滤并淋洗以除去秸秆中的残留氨，烘干后保存备用。经氨水预处理的水稻秸秆中，纤维素、半纤维素和木质素质量分数分别为49.1 %、21.5 %和12.4 %。
2.4 秸秆降解菌剂接种方法首先将彩绒革盖菌以培养5 d的种子液形式接入发酵基质，重组里氏木霉和黑曲霉则以孢子悬浮液(每mL含107个孢子)的形式分别延后1 d和2 d接入，接种比例为彩绒革盖菌: 重组里氏木霉: 黑曲霉=2:2:1，总接种量为10 %(每mL配10 g基质)。
2.5 秸秆降解与有机物污染土壤生物修复的耦合过程试验在11 cm×16 cm×5 cm的长方体生物反应器内，加入500 g、厚度约为10 cm的污染土壤以及200 mL自来水(预湿润土壤)，同时铺上25 g、4~5 cm厚的秸秆基质，接入新型秸秆降解菌剂，于自然条件(平均气温25~30℃)下培养，每天分3次共补加45 mL清水以维持秸秆基质的湿度。定时取样检测秸秆基质中的菌种产酶、秸秆降解以及土壤中污染物降解情况。
2.6 秸秆和土壤的取样以及预处理方法秸秆取样和预处理：秸秆的取样采用五点法，即取对角线的交点以及对角线上距交点距离相同的四个点，每个点取等量秸秆，混合后加入pH为4.8的柠檬酸缓冲液浸泡24 h，离心过滤，取上清液测定三种酶的活力，并对秸秆残渣进行组分分析。
土壤取样和预处理：土壤的取样也采用五点法，每个点取等量的表层土壤，混合风干后碾成粉末备用。
2.7 分析测定方法 2.7.1 漆酶活力测定[15]漆酶活力测定采用2, 2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2, 2-azino-bis (3-ethylbenzothiazo line-6-sulfonic acid)，ABTS) 法。以ABTS为底物，取50 μL酶液，加入950 μL、pH=4.0的柠檬酸缓冲溶液，与1 mL 2 mmol·L-1的ABTS溶液混合后在30 ℃下反应2 min，利用分光光度计测定420 nm下吸光值随时间的变化。每分钟消耗1 µmol ABTS的酶量定义为一个漆酶活力单位(IU·mL-1或IU·g-1)。
2.7.2 滤纸酶活力测定[16]滤纸酶活力(filter paper activity，FPA)可用来表征纤维素酶总活力。以Whatman No.1滤纸为底物(1 cm×6 cm)，加入1.5 mL适当稀释的酶液，50 ℃下水浴反应30 min后采用3, 5-二硝基水杨酸(DNS) 法测定还原糖含量。每分钟生成1 μmol葡萄糖(以还原糖计) 所需的酶量定义为一个滤纸酶活力单位(IU·mL-1或IU·g-1)。
2.7.3 木聚糖酶活力测定[17]取0.5 mL适当稀释的粗酶液，加入1 mL质量分数为1.2 %的木聚糖底物，50 ℃下水浴反应30 min后测定还原糖含量。空白试验中除酶液事先灭活外，其余条件不变。每分钟分解底物释放出1 μmol木糖(以还原糖计)所需的木聚糖酶量定义为一个木聚糖酶活力单位(IU·mL-1或IU·g-1)。
2.7.4 水稻秸秆成分分析[18]纤维素含量测定：准确称取1 g样品(记作m1)于250 mL磨口锥形瓶中，加入25 mL体积分数为20 %的硝酸乙醇溶液后安装回流冷凝管，在沸水浴中加热1 h，随后进行真空抽滤，保留滤渣至原锥形瓶中，重复操作至纤维变白。反应结束后再次进行真空抽滤，先用体积分数为20 %的硝酸乙醇溶液洗涤滤渣，再用热水洗涤至甲基橙洗液不显酸性，最后用10 mL无水乙醇洗涤，滤渣于105 ℃下烘干至恒重(记作m2)。纤维素含量由式(1)计算得到。
| $ 纤维素含量=\frac{{m}_{2}}{{m}_{1}}\times 100\%$ | (1) |
半纤维素含量测定：准确称取0.50 g样品(记作m)于250 mL三口烧瓶中，加入10 g NaCl和100 mL质量分数为12 %的盐酸，三个口分别与冷凝器、50 mL分液漏斗与温度计相连，160 ℃下甘油浴中加热，控制蒸馏速度为3 mL·min-1，不断补加30 mL质量分数为12%的盐酸直至馏出液达350 mL，用湿醋酸苯胺试纸检验馏出液中糠醛含量，待糠醛蒸馏完毕后将馏出液全部转移至500 mL容量瓶中，用质量分数为12%的盐酸进行定容。随后移取100 mL至500 mL磨口锥形瓶中，加入250 g冰，待液体温度降至0 ℃后加入25 mL溴化钾-溴酸钾溶液，避光放置5 min后加入10 mL质量分数为10 % 的KI溶液，摇匀后再放置5 min，随后用0.1 mol·L-1硫代硫酸钠标准溶液滴定。临近滴定终点时加入2 mL质量分数为0.5 %的淀粉溶液，待蓝色褪去后记录滴定体积，记作V1，mL。另取100 mL质量分数为12 %的盐酸溶液，重复操作，记录滴定体积，记作V2，mL。半纤维素含量由式(2)计算得到。
| $ 半纤维素含量=\left({V}_{2}-{V}_{1}\right)\times \frac{0.033}{m}\times 100\%$ | (2) |
木质素含量测定：准确称取1 g样品(记作m3)于索氏抽提器中，加入250 mL乙醇-苯混合液，沸水浴中加热抽提3 h，风干后将样品移至烧杯中，加入15 mL质量分数为72 %的硫酸溶液，充分搅拌后于20 ℃水浴中放置2.5 h，随后用300 mL蒸馏水分多次洗涤至500 mL锥形瓶中，安装回流冷凝管并于沸水浴中加热2 h，反应结束后进行真空抽滤，用热水洗涤滤渣至质量分数为10 %的CaCl2洗液不浑浊，105 ℃下烘干至恒重(记作m4)。木质素含量由式(3)计算得到。
| $ 木素含量=\frac{{m}_{4}}{{m}_{3}}\times 100\%$ | (3) |
土壤中土霉素提取：取1 g土壤样品于棕色瓶中，加入10 mL浸提剂(0.1 mol·L-1、pH为4.7的柠檬酸缓冲液)，超声20 min，在转速为3 000 r·min-1的离心机中离心15 min，取上清液，利用高效液相色谱检测土霉素含量。
土霉素检测：取样品1 mL过0.45 μm水膜，利用高效液相色谱仪(Agilent 1200, USA) 进行检测。流动相：0.01 mol·L-1草酸水溶液、乙腈、甲醇体积比为7:2:1，色谱柱为Eclipse XDB-C18 (150 mm×4.6 mm×5 μm)，流速为0.8 mL·min-1，柱温为30 ℃，检测波长为355 nm，进样量为20 μL。以标准品绘制标准曲线，采用外标法定量。降解率由式(4)计算得到。
| $ 降解率=\frac{{c}_{0}-{c}_{1}}{{c}_{0}}\times 100\%$ | (4) |
式中：c0为初始土霉素浓度，mg·kg-1；c1为降解后土霉素浓度，mg·kg-1。
2.7.6 土壤中毒死蜱提取及毒死蜱检测[20]土壤中毒死蜱提取：取土样5 g置于250 mL具塞三角瓶中，加入10 mL混合提取液(丙酮、磷酸和水体积比为98:1:1)，振荡提取1 h。用铺有两层定性滤纸的布氏漏斗抽滤，并用10 mL丙酮分3次洗涤滤渣和滤瓶，将滤液转移至250 mL平底烧瓶中，40 ℃水浴中减压浓缩至约5 mL。将浓缩液移至50 mL分液漏斗并加入20 mL质量分数为3 %的NaCl溶液，用10 mL石油醚分2次提取。弃去水相，合并石油醚相，在旋转蒸发器中浓缩至近干(水浴温度45 ℃)，冷风吹干，加入甲醇定容，用于高效液相色谱测定。
毒死蜱检测：利用高效液相色谱仪进行检测，以甲醇-水溶液为流动相(甲醇、水体积比为85:15)，采用Eclipse XDB-C18色谱柱，流速为1.0 mL·min-1，柱温为25 ℃，检测波长为290 nm，进样量为20 μL。采用外标法定量。
2.7.7 土壤中2, 4, 5-三氯酚提取及2, 4, 5-三氯酚检测土壤中2, 4, 5-三氯酚提取：取土壤样品1 g置于圆底烧瓶中，以正己烷为提取液，使用索氏提取仪提取4 h，将残留物用旋转蒸发器浓缩至2 mL左右，使用无水硫酸钠去除水分，经甲醇适当稀释后用于高效液相色谱测定。
2, 4, 5-三氯酚检测：利用高效液相色谱仪进行检测，以甲醇-水溶液为流动相(甲醇、水体积比为85:15)，采用Eclipse XDB-C18色谱柱，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃，检测波长为220 nm，进样量为20 μL。采用外标法定量。
3 实验结果与讨论 3.1 耦合过程中秸秆的降解进程 3.1.1 产酶进程接种的秸秆降解菌剂中包含的菌种具备高效产出漆酶、纤维素酶和半纤维素酶能力，在自然条件下能快速生长同时产出高活力酶，试验结果如图 1所示。由图可见，发酵初期，随着菌种在基质中的蔓延生长，基质中三种酶的活力也迅速提高。漆酶活力在第10 d达到峰值，为25.31 IU·g-1；滤纸酶活力和木聚糖酶活力分别在第8 d和第12 d达到峰值，分别为240.44和4 537.16 IU·g-1。秸秆主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，纤维素酶、木聚糖酶和漆酶分别作用于这三个组分，能够使基质中的水稻秸秆快速降解。在耦合过程的后期，三种酶的活力都开始呈下降趋势，一方面是由于菌种产酶速率减小，另一方面也是由于酶蛋白向土壤中不断渗漏。
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图 1 耦合过程中发酵产酶进程 Fig.1 Enzyme production during the coupling process |
接入的菌剂在固态发酵过程中产生的高活力的复合酶系有利于实现秸秆的快速降解。耦合过程中秸秆失重率与秸秆各组分降解情况如图 2所示。由图可见，随着基质中酶的活力迅速上升，发酵初期秸秆中的纤维素被快速降解，发酵8 d降解率就达到了65.78 %、第12 d降解率高达75.4 %；半纤维素的降解率略高于纤维素，到第12 d降解率达到77.33 %。
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图 2 耦合过程中秸秆降解进程 Fig.2 Straw degradation during the coupling process |
发酵过程中分泌的漆酶对秸秆中的木质素具有明显降解作用。木质素是一种高度交联的芳香族杂聚物，它的结构复杂性和无规律性导致其难以降解[21]。漆酶是一种木质素解聚酶，可以使木质素解聚、改性，实现木质素降解[22]。由图 2可见，在漆酶作用下，木质素逐渐降解，到第12 d降解率达到32.35 %。漆酶对木质素的降解对于耦合过程具有重要意义，它不仅提高了秸秆的协同降解效果，而且在木质素降解过程中产生的一些小分子酚类物质还可以作为漆酶的介体[8]。木质素降解过程中产生的小分子物质常见的有丁香醛、香草醛、乙酰丁香酮等，研究表明，这些小分子物质不仅能像人工合成介体一样提高漆酶的降解能力，同时具有成本低廉、环境友好的优点；在某些方面天然介体还具有比人工合成介体更好的表现，是优良的人工合成介体在未来应用中的替代品[23-25]。
由图 2可见，随着秸秆各主要组分的降解，固态发酵基质中的秸秆被迅速消耗，发酵第8 d，秸秆的失重率就达到了51.3%，到第12 d失重率可达到60.19%。
3.2 耦合过程中含土霉素土壤的生物修复进程按照2.4节所述方法，将秸秆铺在含土霉素的土壤上方，接入秸秆降解菌剂后，定时取样检测秸秆基质中的漆酶活力以及土壤中土霉素含量变化，试验结果如图 3所示。由图可见，在发酵前期，基质之中的漆酶活力随着发酵进行不断上升，到第8 d漆酶活力达到了峰值，为19.72 IU·g-1。第8 d开始菌种生长繁殖减缓、产酶效率降低，同时酶不断向土壤中渗漏，基质中的漆酶活力开始呈下降趋势。土霉素降解与漆酶的活力呈正相关，随着漆酶活力逐步提高，土霉素被快速降解。在第8 d土霉素降解率就达到了84.24 %、第12 d达到93.4 %，与对照组相比降解速度大大提升。第8 d开始，土壤中的土霉素降解速度开始变缓，一方面是因为漆酶活力下降使总体降解效率降低，另一方面是因为土霉素大部分已经被降解、土壤中的土霉素变少，这也是降解速度变缓的重要原因。
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图 3 耦合过程中漆酶活力变化及土壤中土霉素降解进程 Fig.3 Profiles of laccase production and oxytetracycline degradation in soil |
抗生素在畜牧业中被广泛使用，而且相当比例的抗生素不能被动物吸收利用，会随着动物粪便进入环境、污染土壤。已有研究表明，漆酶也对磺胺类抗生素有很高的降解效果[26]。由此，本研究所采用的方法也适用于其他多种抗生素污染的土壤，具有良好的应用前景。
3.3 耦合过程中含毒死蜱土壤的生物修复进程为了研究耦合过程对含有其他污染物的土壤修复效果，将耦合过程应用于毒死蜱污染土壤的生物修复，实验结果如图 4所示。由图可见，漆酶活力在第8 d达到最高值，为20.14 IU·g-1，之后急速下降。而漆酶活力变化趋势则与土壤中毒死蜱降解率的变化规律密切相关，漆酶活力高毒死蜱降解率也高。前10 d，在漆酶作用下，土壤中的毒死蜱逐渐被降解；10 d后，毒死蜱降解速度开始放缓；到第12 d，土壤中的毒死蜱降解率达到了62.34 %，与对照组相比高了8倍多。但与土霉素污染土壤相比，毒死蜱污染土壤中毒死蜱降解率相对较低，说明本研究所使用方法对土壤修复效果与污染物种类有较大关系。
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图 4 秸秆基质中漆酶活力的变化及土壤中毒死蜱的降解进程 Fig.4 Profiles of laccase production and chlorpyrifos degradation in soil |
毒死蜱作为使用量巨大的有机磷农药，其对土壤造成的污染已引起环保工作者的高度关注。WANG等[27]利用固定化漆酶降解土壤中的毒死蜱，虽然取得了明显的降解效果，但该工艺成本太高、难以实际应用。本研究所采用的方法简便、易行，不仅实现了秸秆的快速降解，而且还可使土壤中的毒死蜱得到有效降解，具有良好的推广应用价值。
3.4 耦合过程中含2, 4, 5-三氯酚土壤的生物修复进程本实验还探究了耦合过程对含2, 4, 5-三氯酚的土壤生物修复效果。实验时天气转冷，气温25 ℃左右，实验结果如图 5所示。由于气温降低，使得发酵过程中产酶速率变慢、产酶进程延后，漆酶活力在第12 d才达到最大值18.87 IU·g-1。在漆酶作用下，土壤中的2, 4, 5-三氯酚逐渐被降解，第4~8 d降解速度最快，第8 d时2, 4, 5-三氯酚降解率达到了52.26 %、第12 d达到65.21 %。而在对照组土壤中2, 4, 5-三氯酚几乎没有降解。
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图 5 秸秆基质中漆酶活力的变化及土壤中2, 4, 5-三氯酚的降解进程 Fig.5 Profiles of laccase production and 2, 4, 5-TCP degradation in soil |
值得注意的是，第10~12 d，2, 4, 5-三氯酚仍然保持着不低的降解速度，这说明降解过程没有停止，延长时间可得到更高降解率，因此，在后续工作中可通过延长耦合过程或者多轮耦合过程来提高有机污染物的降解率，提高土壤修复效果。
Lisov等[28]研究发现，在反应体系里添加1-羟基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole，HBT)作为介体可以有效提高漆酶对多氯酚的作用效果，但HBT这种人工合成介体价格较高，同时有可能会对土壤环境造成二次污染，所以在实际应用中有很大局限。本研究中，由于秸秆木质素在降解过程中会产生一些小分子酚类物质，它们可以作为天然介体可促进漆酶对2, 4, 5-三氯酚的降解，所以无需外加人工合成介体也能获取得较高降解率。利用耦合过程中形成的漆酶/天然介体系统进行污染土壤修复是一个非常值得大力拓展的研究课题。
4 结论采用由重组里氏木霉、彩绒革盖菌和黑曲霉所组成的复合菌系，将秸秆高效降解与污染土壤修复过程进行有机耦合，耦合过程中，微生物利用秸秆基质固态发酵可生成高活力纤维素酶、木聚糖酶和漆酶，使秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素被加速降解，接种后第12 d秸秆失重率可达到60.19 %。同时，固态发酵过程中生成的漆酶又可以降解土壤中的土霉素、毒死蜱、2, 4, 5-三氯酚等多种有机污染物，耦合过程第12 d，土壤中的土霉素、毒死蜱、2, 4, 5-三氯酚降解率分别可达到93.4%、62.34 %和65.21 %。研究结果表明，将秸秆快速降解过程与污染土壤修复过程有机结合是一条经济、安全、有效的新途径。
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