2. 214000 无锡，无锡市第三人民医院骨科
2. Department of Orthopedics, Third People's Hospital of Wuxi, Wuxi 214000, Jiangsu, China
国际骨质疏松基金会发表的一组数据显示，全球每3秒钟就会发生一起骨质疏松性骨折，1/3的女性和1/5的男性会在50岁后遭遇一次骨折，20%的髋部骨折患者会在骨折后的6个月内死亡[1]。因此，完善骨质疏松症危险因素的研究并给予针对性的治疗就显得尤为重要。2012年Kim等[2]对940名健康女性 (年龄≥40岁) 进行3年队列研究，结果提示，血清铁蛋白的初始水平与骨量丢失的速率呈正相关，铁蛋白升高与骨折风险增加呈正相关，“Ⅰ型骨质疏松症”中“铁蓄积”是一个“后天因素”。
已有研究表明，铁蓄积可以促进骨吸收，降低雄性小鼠胫骨骨量[3]。但是降低铁含量能否改善去卵巢小鼠 (模拟人绝经后状态) 的骨量尚不明确。本研究构建了去卵巢铁蓄积小鼠，模拟人绝经后铁蓄积状态，并采用临床上常规使用的口服降铁药去铁斯若 (deferasirox，DFR) 对绝经后铁蓄积小鼠进行干预，旨在观察降铁药物对于铁蓄积相关骨代谢异常的疗效，为骨质疏松症的防治提供新的策略。
材料与方法 主要材料、仪器Micro-CT (SKYSCAN，1176型)，全自动生化分析仪 (日本奥林巴斯公司)，酶标仪 (Bio-tech公司)，Ⅰ型胶原羧基末端肽 (carboxy-terminal telopeptide of type 1 collagen, CTX) (Sigma公司)、骨钙素 (bone gla protein，BGP)(Sigma公司)，水合氯醛 (国药集团化学试剂有限公司)，注射用枸橼酸铁铵 (Sigma公司)，0.9%氯化钠注射液 (中国大冢制药有限公司)
实验方法实验动物分组及处理：选用8周龄C57雌性小鼠，体质量 (31±2) g，共32只。适应性喂养1周后，将2月龄小鼠采用数字表法随机分为假手术Sham组，去卵巢 (ovariectomy，OVX) 组，加枸橼酸铁铵 (ferric ammonium citrate，FAC) 即 (OVX+FAC) 组以及去DFR (OVX+FAC+DFR) 组，每组C57小鼠各8只。Sham组：切开皮肤、肌肉仅探及卵巢，不去除卵巢，排除手术这一技术操作对实验结果的干扰；OVX组：切开皮肤、肌肉后切除小鼠双侧卵巢，造成去卵巢骨质疏松模型；OVX+FAC组：切除小鼠双侧卵巢后给予枸橼酸铁铵80 mg/kg (溶于0.9%氯化钠注射液) 腹腔注射，每周3次，共持续5周，造成去卵巢合并铁过载的骨质疏松模型；OVX+FAC+DFR组：切除小鼠双侧卵巢后给予枸橼酸铁铵 (溶于0.9%氯化钠注射液) 腹腔注射，每周3次，共持续5周，造成去卵巢合并铁过载的骨质疏松模型；之后给予去铁斯若100 mg/kg (溶于0.9%氯化钠注射液) 灌胃，每周5次，持续6周。其余各组给予相应的5周0.9%氯化钠注射液腹腔注射对照或6周0.9%氯化钠注射液灌胃对照。
标本收集：各组小鼠到干预时间终点后用4%水合氯醛以1 mL/100 g剂量麻醉，摘眼球取血1 mL，3 000 r/min离心15 min，取上层血清用于检测。取左侧胫骨，剔除骨周围的肌肉，胫骨冻存在-80 ℃冰箱。
血清指标测定：ELISA法检测血清铁蛋白 (ferritin, Fer)、CTX、BGP含量。具体操作步骤按说明书进行。
胫骨普鲁士蓝染色：将骨组织修剪成体积为2 mm×2 mm×2 mm，用体积分数为10%的甲醛溶液固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，甲基丙烯酸甲酯包埋，硬组织切片机 (SM2500，LEICA，德国) 切成5 μm不脱钙骨组织切片，行普鲁士蓝铁染色。
Micro-CT扫描股骨远端进行三维重建：取左侧股骨，放入micro-CT (Skyscan，1176型) 样品杯中固定。扫描条件为：电压50 kV，电流500 μA，步长0.5°，在相同的条件下扫描并进行三维重建，扫描后得到的数据进行统计分析。
统计学方法应用统计软件SPSS 17.0对数据进行统计学分析，组间比较采用ANOVA分析，各数据指标以平均值±标准差 (x±s) 表示，以P < 0.05为差异有统计学意义。
结果 DFR能降低血清铁蛋白水平与Sham组相比，OVX组小鼠血清铁蛋白水平差异无统计学意义 (P > 0.05)；而OVC+FAC组小鼠铁蛋白水平 (220.7±28.3)μg/L与Sham组 (112.8±6.0)μg/L相比显著升高 (P < 0.05)，因此OVX+FAC组小鼠能更好地模仿人绝经后铁蓄积状态；使用DFR干预后，OVX+FAC+DFR组小鼠血清铁蛋白水平 (151.5±36.1)μg/L较OVC+FAC组 (220.7±28.3)μg/L显著降低 (P < 0.05)(图 1)。
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| 图 1 各组小鼠体内铁蛋白含量 Figure 1 Ferritin levels in mice among different groups Sham：假手术；OVX：去卵巢；FAC：枸橼酸铁铵；DFR：去铁斯若；与OVX组比较，*P < 0.05；与OVX+FAC组比较，#P < 0.05 |
对4组实验小鼠的胫骨切片后，行普鲁士蓝铁染色。结果显示，与Sham组相比，去卵巢OVX组小鼠的胫骨骨小梁出现少量的蓝染增多；而OVC+FAC组小鼠胫骨骨小梁与OVX组相比出现了明显的蓝色铁沉积表现。使用DFR干预后，OVX+FAC+DFR组小鼠胫骨骨小梁的铁沉积较OVX+FAC组明显减少 (图 2)。
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| 图 2 各组小鼠胫骨骨铁染色 Figure 2 Perl's staining for bone iron in mice tibia among different groups Sham：假手术；OVX：去卵巢；FAC：枸橼酸铁铵；DFR：去铁斯若 |
股骨三维重建图像显示：与OVX组相比，OVX+FAC组小鼠骨小梁数目明显减少变细，近乎消失。而与OVX+FAC组相比，OVX+FAC+DFR组的骨小梁明显增多增厚。此外，DFR干预后OVX+FAC+DFR组小鼠骨小梁数目及厚度仍小于OVX组 (图 3)。为了进一步验证三维图像的结果，本研究定量地分析了各实验小鼠的骨密度、骨体积分数、骨小梁数目和骨小梁厚度。与OVX组相比，OVX+FAC组及OVX+FAC+DFR组的骨密度、骨体积分数、骨小梁数目和骨小梁厚度都显著降低 (P < 0.05)。而与OVX+FAC组相比，OVX+FAC+DFR组小鼠股骨的骨密度、骨体积分数、骨小梁数目和骨小梁厚度都有显著恢复 (P < 0.05)(表 1)。
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| 图 3 各组小鼠股骨下段三维重建 Figure 3 Three dimensional reconstruction of lower end of femur of mice among different groups Sham:假手术；OVX:去卵巢；FAC:枸橼酸铁铵；DFR：去铁斯若 |
| 组别 | 骨密度 (mg/mm3) | 骨体积分数 (%) | 骨小梁数目 (N/mm) | 骨小梁厚度 (μm) |
| Sham | 0.24±0.026 | 19.11±3.37 | 3.72±0.56 | 43.93±1.99 |
| OVX | 0.13±0.012 | 11.55±2.12 | 1.48±0.41 | 26.50±1.56 |
| OVX+FAC | 0.074±0.01* | 4.76±1.87* | 0.71±0.13* | 14.3±3.73* |
| 去铁斯若 (OVX+FAC+DFR) 组 | 0.11±0.015#* | 9.70±2.56#* | 1.17±0.16#* | 22.47±2.65#* |
| Sham：假手术；OVX：去卵巢；FAC：枸橼酸铁铵；DFR：去铁斯若；与OVX组比较，*P < 0.05；与OVX+FAC组比较，#P < 0.05 | ||||
采用酶联免疫吸附法 (ELISA) 检测了各实验组小鼠血清BGP以及CTX两种骨转换指标，结果发现，与Sham组相比，OVX组和OVX+FAC组小鼠血清中BGP及CTX水平明显升高；与OVX组相比，OVX+FAC组小鼠血清BGP及CTX指标显著升高 (P < 0.05)；DFR干预后，OVX+FAC+DFR组小鼠血清BGP及CTX水平较OVX+FAC组显著降低 (P < 0.05)(图 4)。
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| 图 4 各组小鼠骨钙素、Ⅰ型胶原羧基末端肽的水平 Figure 4 BGP, CTX levels in mice among different groups Sham：假手术；OVX：去卵巢；FAC：枸橼酸铁铵；DFR：去铁斯若；BGP:骨钙素；CTX:1型胶原羧基端肽；与OVX组比较，*P < 0.05；与OVX+FAC组比较，#P < 0.05 |
随着社会人口老龄化，骨质疏松症的发病率越来越高；但是，骨质疏松症形成原因和防治方法依然存在许多空白，鉴于骨质疏松症可引起骨折及相关并发症，严重危害老年人健康，加重国家经济负担，我国对骨质疏松症的重视程度正逐年提高[4-5]；在各项研究中，铁代谢作用与骨质疏松症关系密切是这些年国内、国外研究的新热点。
2008年Weinberg[6]提出“Role of iron in osteoporosis”，在世界上首次正式提出“铁是骨质疏松发生发展的危险因素之一，此后陆续有基础研究证实该观点。2012年JBMR发表韩国Kim等[2]的研究，首次利用临床证据阐明铁对骨质疏松的危害：对4年内韩国体检人群数据，横向比较男女骨密度及铁蛋白水平差异，并采用相关分析论证“健康人‘铁过多’是骨密度下降的一个独立危险因素”；同年，该临床研究被Nature Reviews Endocrinology引用并“评论”[7]：该项研究意义在于提出了骨质疏松防治新理念。2013年Bone发表“专家述评”[8]：提出骨质疏松症的性别差异与“铁代谢异常”相关。本研究组也发现“铁代谢与骨质疏松相关”，并发表了相关的研究论文和专家论坛[9-11]。基于上述研究，采用降铁方法治疗绝经后骨质疏松症成为一种很有前景治疗手段。去铁斯若是一种口服铁鳌合剂，不同于静脉给药的铁螯合剂，去铁斯若只需每天口服一次，极大地提高了患者的依从性。本研究采用铁剂干预去卵巢小鼠，造成骨质疏松合并铁蓄积模型，随后给予去铁斯若灌胃，观察该药对铁蓄积小鼠骨量丢失的治疗作用。
在本研究中，单纯去卵巢小鼠骨量丢失明显，同时予腹腔注射枸橼酸铁铵造成铁蓄积后小鼠骨量进一步丢失。实验结果提示，与假手术组相比，去卵巢小鼠血清铁蛋白水平差异无统计学意义 (P > 0.05)，提示小鼠因没有周期性阴道排血，去卵巢后不会发生铁蓄积；而腹腔注射枸橼酸铁铵后小鼠铁蛋白水平与假手术组相比显著升高，说明给予去卵巢小鼠补充外源性铁，进而模拟人绝经后铁过载状态是可行的。这一结论与早前另一研究的结论一致[12]，说明铁蓄积是绝经后小鼠骨量丢失的一个独立危险因素。使用去铁斯若干预后，小鼠血清铁蛋白水平显著降低，说明DFR能降低去卵巢铁蓄积小鼠血清铁蛋白水平，口服降铁效果明显。同时，笔者发现骨铁水平与血清铁蛋白的变化是一致的，提示DFR不仅能降低血清铁水平，还能降低铁蓄积小鼠骨组织铁。本团队前期研究已证实绝经后妇女骨组织存在铁蓄积[12]，本实验中这一结果为药物清除人骨组织蓄积的铁提供了实验依据。为了研究铁水平变化与骨形态及骨代谢的相关性，笔者对各组小鼠股骨进行三维扫描，证实DFR抗骨质疏松治疗有效，且这一疗效与降低骨骼及血液中的铁蛋白进而降低骨转换水平有关[13]。
目前DFR对骨质疏松的改善作用仍未有相关报道，其机制也未阐明。结合当前研究，铁对骨质疏松的促进作用可能与氧化应激相关。铁在体内通过Fenton反应，产生OH-等活性氧 (reactive oxygen species，ROS)。活性氧主要损伤细胞线粒体，尤其是成骨细胞，进而导致成骨细胞增生分化受损；另一方面，ROS也是胞内第二信使，能传递并激活下游相关信号通道。目前已知ROS能上调破骨细胞分化相关的NF-κB及MAPK信号通道，使破骨细胞分化能力增强，导致骨质疏松[14]。因此，我们有理由相信：DFR对骨代谢的保护可能与氧化应激的调控的有关。
综上所述，本研究结果发现铁蓄积可以加快骨转换，增加骨丢失，DFR干预后可部分改善铁蓄积对骨的这种不良影响，表明口服铁螯合剂对铁蓄积相关性的骨量下降或骨质疏松有一定的治疗作用。
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| (收稿日期：2016-09-13) |